細(xì)胞凋亡一直都是細(xì)胞生物學(xué)研究的熱點(diǎn)，這個(gè)復(fù)雜的過(guò)程涉及多條通路，可以用多種方法在不同的階段進(jìn)行檢測(cè)。細(xì)胞凋亡晚期，細(xì)胞核發(fā)生形態(tài)變化、染色質(zhì)凝聚、核膜降解、DNA片段化。
TUNEL（脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法）是檢測(cè)DNA片段化的成熟方法，自1992年發(fā)表以來(lái)經(jīng)過(guò)不斷改進(jìn)，縱橫實(shí)驗(yàn)室逾20年，至今仍然是廣泛采用的凋亡檢測(cè)方法，這是因?yàn)門UNEL能夠與其他細(xì)胞學(xué)技術(shù)很好的契合。比如，使用TUNEL分析進(jìn)行凋亡研究有一個(gè)好處，研究人員在TUNEL法標(biāo)記細(xì)胞之后，在直接檢測(cè)和定位凋亡信號(hào)的同時(shí)，還可以通過(guò)抗體在同一個(gè)樣本上檢測(cè)細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)的生物學(xué)指標(biāo)。
TUNEL的基本原理：DNA斷裂時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量的粘性3'-OH末端，在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，將生物素或熒光素或digaoxin標(biāo)記的dUTP摻入到DNA的3'-末端，可通過(guò)一定的顯色系統(tǒng)使之顯示出來(lái)。過(guò)去，TUNEL算得上是個(gè)值得“用心摸索”的試劑盒，因?yàn)橛悬c(diǎn)技術(shù)難度。如今市場(chǎng)上的TUNEL檢測(cè)產(chǎn)品有了哪些改進(jìn)和新選擇呢？ 
考慮通透性和標(biāo)記
TUNEL檢測(cè)的一個(gè)關(guān)鍵要素是把握好細(xì)胞透化的時(shí)間。透化的目的是通透細(xì)胞膜和核膜，通俗說(shuō)就是在膜上打孔，讓反應(yīng)試劑得以充分進(jìn)入細(xì)胞核進(jìn)行反應(yīng)，提高檢測(cè)效果。門開(kāi)小了大家俬不好進(jìn)場(chǎng)，若透化不足可能檢測(cè)不到凋亡的特征，造成假陰性?？砷_(kāi)孔太過(guò)又影響形態(tài)，透化時(shí)間太長(zhǎng)還容易脫片。 
DNA的標(biāo)記是另一個(gè)重要的影響因素。標(biāo)記分子太大則不利于TdT將其摻入DNA片段。早期的分析中dUTP通常用生物素或熒光素標(biāo)記，由于熒光基團(tuán)的“大塊頭”，使得其標(biāo)記的dUTP摻入DNA的效率要低于預(yù)期。后來(lái)改進(jìn)為利用Br-dUTP來(lái)取代生物素或熒光素標(biāo)記的dUTP，因?yàn)殇宸肿颖葻晒馑?、生物素等?biāo)記物要小得多，因此Br-dUTP更容易被摻入凋亡細(xì)胞的DNA片段中，再經(jīng)過(guò)Br-dUTP抗體識(shí)別、以及抗體上偶聯(lián)的生物素或熒光素放大或顯色，使得zui后的檢測(cè)信號(hào)也更強(qiáng)。但是，Br-dUTP要用抗體檢測(cè)，要求嚴(yán)謹(jǐn)?shù)姆磻?yīng)條件。
更好的選擇是EdUTP，這種以炔烴基團(tuán)（一種小分子基團(tuán)）修飾的dUTP比Br-dUTP更小，更容易被TdT摻入到DNA末端。更妙的是，EdUTP的檢測(cè)不需要經(jīng)過(guò)抗體，而是通過(guò)一步高度特異性的click反應(yīng)（一種銅催化的疊氮化物與炔烴之間的反應(yīng)），將摻入DNA的EdUTP上的炔烴基團(tuán)，與疊氮化合物（偶聯(lián)生物素或熒光素）共價(jià)連接，再借助疊氮化物上的生物素或熒光標(biāo)記，可實(shí)現(xiàn)靈敏的TUNEL檢測(cè)。與BrdU抗體（分子量約為150 kDa）相比，這個(gè)疊氮化物的大小僅為1%（分子量<~1000 Da），通透性要好得多。 
click技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于疊氮化物和炔烴都是極小的惰性基團(tuán)，因此，只需要溫和的固定和透化條件，即可達(dá)到讓試劑充分滲透進(jìn)入細(xì)胞核。同時(shí)，高度特異的click反應(yīng)可實(shí)現(xiàn)更低的背景干擾，和更穩(wěn)定的共價(jià)結(jié)合產(chǎn)物，從而更好地檢測(cè)凋亡細(xì)胞。此外，升級(jí)版的Click-iT Plus技術(shù)無(wú)需銅的參與，染料兼容性更廣泛，在多色檢測(cè)中表現(xiàn)更出色。

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