夜夜添无码试看一区二区三区,美女胸大18禁止网站,国产日韩一区二区,玖玖精品国产,xvideos国产在线视频

熱門搜索: 抗血漿鑒別試劑盒 甲種胎兒球蛋白抗原 重組核心鏈霉親和素 2(不帶標(biāo)簽) 重組鏈霉親和素(r-ScSA)(NC膜專用) 重組鏈霉親和素(帶His標(biāo)簽) 羊抗人視-黃醇結(jié)合蛋白多克隆抗體 大鼠白細(xì)胞介素1β(IL-1β)試劑盒(ELISA) 人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子ELISA試劑盒 1%豚鼠紅細(xì)胞 2%雞紅細(xì)胞 1%雞紅細(xì)胞 重組人線粒體核糖體蛋白S2(MRPS2) 重組人蛋白酶體激活物亞基1(PSME1)蛋白 重組人肝癌衍生生長(zhǎng)因子相關(guān)蛋白3 重組人FAM83A蛋白 重組人ER膜蛋白復(fù)合物亞基8蛋白(COX4NB)

PRODUCT CLASSIFICATION

產(chǎn)品分類

技術(shù)文章/ Technical Articles

您的位置:首頁  /  技術(shù)文章  /  上海信帆生物:免疫組化實(shí)驗(yàn)中遇到的問題分析

上海信帆生物:免疫組化實(shí)驗(yàn)中遇到的問題分析

更新時(shí)間:2016-05-13      瀏覽次數(shù):1698

案例一:DAB染色后切片著色一片黃/背景深

背景:奧運(yùn)會(huì)期間我們課題組研究生都在實(shí)驗(yàn)室做實(shí)驗(yàn),許多從北京購(gòu)買的試劑買不到,對(duì)我們的許多實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生了很大的影響。我以前一直用中杉金橋的Sp三步法染色試劑盒,效果不錯(cuò),在奧運(yùn)會(huì)期間我準(zhǔn)備做同批實(shí)驗(yàn)分不同批次酶免疫組化實(shí)驗(yàn),*批組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果很好,抗體濃度感覺比較合適(Santa Cruz公司1:200),等做第二批時(shí)發(fā)現(xiàn)封閉血清不夠了,為了保證實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行,我又從福州邁新頂了一個(gè)SP試劑盒,同時(shí)抗體稀釋液也不夠了,我又重新從博士德公司買了一小瓶10ml。從第二批實(shí)驗(yàn)開始,組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果一直顯示強(qiáng)背景著色,特異性染色很難辨別。

問題及其解答:產(chǎn)生組織切片非特異性染色的原因有哪些?如何解決?

1、 抗體孵育時(shí)間過長(zhǎng)、抗體濃度高易增加背景著色。這可通過縮短一抗/二抗孵育時(shí)間、稀釋抗體來控制。這是zui重要的一條。

2、 一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色,建議試用單克隆抗體看看。

3、內(nèi)源性過氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高(含血細(xì)胞多的組織),需要通過延長(zhǎng)滅活時(shí)間和增加滅活劑濃度來降低背景染色;

4、 非特異性組分與抗體結(jié)合,這需要通過延長(zhǎng)二抗來源的動(dòng)物免疫血清封閉時(shí)間和適當(dāng)增加濃度來加強(qiáng)封閉效果;

5、 DAB孵育時(shí)間過長(zhǎng)或濃度過高;

6、 PBS沖洗不充分,殘留抗體結(jié)果增強(qiáng)著色,在一抗、二抗或SP孵育之后的浸洗尤為重要;

7、 標(biāo)本染色過程中經(jīng)常出現(xiàn)干片,這容易增強(qiáng)非特異性著色。

我的實(shí)際解決方案:

以上的分析可能對(duì)于初學(xué)者還是不容易的,下面我就把我的排除實(shí)驗(yàn)的具體過程與大家進(jìn)行分享、交流和討論。

1、首先排除抗體孵育條件。一般來說,著色效果的好壞與抗體的孵育條件是密不可分的,由于用SP法已經(jīng)做出來過一次且效果不錯(cuò),因此對(duì)于同樣組織的同一抗原進(jìn)行分析,這種因素可以先排除。

2、其次,DAB孵育時(shí)間是否太長(zhǎng)?做出來那一次我是孵育8min,后來也是8-10min,我單獨(dú)做了一次實(shí)驗(yàn)來排除該因素。結(jié)果孵育2、5min時(shí)先出現(xiàn)背景,而特異性染色較淺,故這不符合常理,一般先出現(xiàn)特異性染色,然后隨著時(shí)間的延長(zhǎng),會(huì)出現(xiàn)非特異性背景著色。

3、zui后,血清封閉的問題?以前我一般孵育15-30min,所以我單獨(dú)做了一次實(shí)驗(yàn)用血清封閉室溫1h,其它條件同做出來的那一次,結(jié)果也一樣背景著色很深。

4、此外,我在改進(jìn)的同時(shí),也對(duì)PBS清洗不斷地延長(zhǎng)時(shí)間和增加次數(shù),甚至*參照試劑盒說明書來進(jìn)行操作(我以前一般一抗4度且室溫復(fù)溫45min、二抗37度30min、Sp反應(yīng)37度30min),以及過氧化氫滅活加強(qiáng)等等均未起到效果。

我冷靜地分析了一下整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程,與*次做出來相比,只有兩個(gè)地方做了改動(dòng):因血清不夠而更換了不同廠家試劑盒、因抗體稀釋液用完而重新買了抗體稀釋液。

5、我用PBS替代一抗稀釋液(我以前還回收抗體,自我覺得抗體稀釋液中含防腐劑和蛋白穩(wěn)定劑),其它步驟和組織切片*與*次做出來的一致(包括血清也是老試劑盒內(nèi)剩余的一點(diǎn)),奇跡出現(xiàn)了:結(jié)果很好。--因?yàn)榭乖贵w反應(yīng)除溫度、抗原/抗體濃度外,然后就是PH值,于是我測(cè)了新抗體稀釋液、老抗體稀釋液和PBS的PH值,結(jié)果是前者偏酸性(<6、0),而后兩者均在7、5左右。

6、看來主要禍根是抗體稀釋液的PH值出問題了,于是我又用PBS替代抗體稀釋液和新試劑盒內(nèi)的試劑對(duì)組織切片做了免疫組化,結(jié)果還是沒有做出來:背景很深。這真把我搞慘了。難道還有什么原因嗎?通過仔細(xì)分析:一抗一定是結(jié)合上去了(老SP試劑盒結(jié)果很好),問題是二抗沒有結(jié)合上去也不對(duì)(因?yàn)閦ui后背景很深,這說明二抗可能也結(jié)合上去了),DAB孵育時(shí)間現(xiàn)在只用1、5min也是背景深而特異性染色淺,那我又懷疑封閉血清了。

7、我做了兩張切片:一張用老試劑盒內(nèi)還剩下一點(diǎn)的血清而另一張用新試劑盒內(nèi)的封閉血清,其余試劑(二抗、SP)均用新試劑盒提供的,結(jié)果是前一張效果很好,而后一張能夠看到特異性染色,但背景太深,拍照效果不佳。--看來封閉血清也是罪會(huì)禍?zhǔn)字弧?/p>

結(jié)果分析顯示:抗體稀釋液的PH值偏低和封閉血清的失效導(dǎo)致了我的免疫組化結(jié)果的不佳,望大家在以后的組化實(shí)驗(yàn)中也要注意這兩個(gè)不太引人注意的關(guān)鍵問題。--慘痛的教訓(xùn),值得引以為鑒。

案例二:DAB染色后切片著色呈陰性結(jié)果

背景:其實(shí)免疫組化在DAB染色后一般有四種情況:陽性染色效果很好、陰性染色、非特異性染色很深、陰陽臉(染色不均勻)。而陰性染色是許多初學(xué)者經(jīng)常遇到的頭疼問題。我身邊有個(gè)研究生同學(xué)在我們實(shí)驗(yàn)室初次涉入免疫組化,聽說步驟不難,跟我后面做了幾次之后,就自己開始做了,連續(xù)做了三次,結(jié)果均是陰性染色。很掃興,不知是什么原因?qū)е碌摹?/p>

問題及其解答:免疫組化染色呈陰性結(jié)果的原因有哪些?

1、抗體濃度和質(zhì)量問題以及抗體來源選擇錯(cuò)誤。不知抗體是進(jìn)口的還是國(guó)產(chǎn)的工作液,怎么這么高稀釋度也沒能做出陽性結(jié)果?另外,不是抗體濃度越高就越易出現(xiàn)陽性結(jié)果,抗原抗體反應(yīng)有前帶和后帶效應(yīng),必須摸索*濃度。

2、抗原修復(fù)不全,對(duì)于甲醛固定的組織必須用充分抗原修復(fù)來打開抗原表位,以利于與抗體結(jié)合;建議微波修復(fù)用高火4次*6min試試。有人做過實(shí)驗(yàn),這是*的時(shí)間和次數(shù)。若不行,還可高壓修復(fù)。

3、組織切片本身這種抗原含量低;

4、血清封閉時(shí)間過長(zhǎng)。

5、DAB孵育時(shí)間過短。

6、細(xì)胞通透不全,抗體未能充分進(jìn)入胞內(nèi)參與反應(yīng)。

7、開始做免疫組化,我建議你一定要首先做個(gè)陽性對(duì)照片,排除抗體等外的方法問題。

我的實(shí)際解決方案:

1、首先,排除組織切片內(nèi)的抗原有無丟失及其含量多少。免疫組化中兩個(gè)zui重要的因素是抗原和抗體。(1)抗原有無丟失主要看組織切片的新鮮程度,一般切片室溫保存超過3-6個(gè)月,可能切片內(nèi)的抗原丟失很嚴(yán)重(有文獻(xiàn)支持),此時(shí)可以通過重新用石蠟塊切片來進(jìn)一步驗(yàn)證(蠟塊需要低溫保存)。(2)石蠟切片在制作過程中可能因醛基對(duì)抗原決定族的封閉,這需要通過抗原修復(fù)來充分暴露,從而增加抗原抗體結(jié)合反應(yīng),提高陽性率,我一般用6min*4次中火微波抗原修復(fù),用枸櫞酸鈉緩沖液。(3)組織切片中本身抗原含量的多少?這方面我有教訓(xùn)的,我做胎鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞鑒定,用1:200一抗效果很好;但我用1:200一抗孵育成年睪丸間質(zhì)細(xì)胞檢測(cè),幾乎呈陰性,后來證實(shí)是因?yàn)閮烧呖乖肯嗖钌踹h(yuǎn),則一抗也要適當(dāng)提高濃度。

2、其次,檢查抗體有無選擇錯(cuò)誤和抗體孵育條件是否不適。(1)一抗選擇單克隆抗體易出現(xiàn)陰性結(jié)果,因?yàn)殪`敏度低但特異性好;一抗的species reactivity中無檢測(cè)組織的種屬,這是比較常見的錯(cuò)誤;一抗選擇rat,而二抗是抗mouse/rabbit等均有可能出現(xiàn)陰性結(jié)果。(2)抗體孵育時(shí)間過短,容易導(dǎo)致陰性結(jié)果。一般一抗我建議4度孵育和37度復(fù)溫45min;二抗我一般37度30min。我不喜歡參照二抗染色試劑盒說明書。(3)抗體濃度過低。這是陰性結(jié)果的zui可能原因。必須提高稀釋度,我一般初次做一種新抗體,喜歡先用說明書建議的低濃度和高濃度做一次,然后決定是向高還是低方向摸索。一般先決定二抗的濃度(工作液就好辦了,直接滴加),重點(diǎn)摸索一抗的zui適濃度。注意:免疫反應(yīng)中存在前帶和后帶效應(yīng),這提示不是濃度越高,陽性率就越高,反之亦然。(4)重要原因排除之后,也不要忽視抗體的質(zhì)量:原裝抗體一般比較穩(wěn)定,效果較好;而進(jìn)口分裝次之;工作液可能要注意質(zhì)量問題。

3、同時(shí),DAB的孵育時(shí)間可能要適當(dāng)延長(zhǎng),在鏡下觀察,有時(shí)可延長(zhǎng)至30min。但一般3-10min,此時(shí)背景也較淺。否則,說明抗體濃度不合適。

4、zui后,血清封閉時(shí)間也可相應(yīng)縮短。一般10-30min,但這個(gè)時(shí)間可以調(diào)整,封閉主要是降低切片的總體背景著色。

5、此外,細(xì)胞通透也不可忽視。許多戰(zhàn)友認(rèn)為石蠟切片一般不需細(xì)胞通透,因?yàn)榍衅瑫r(shí)可能已經(jīng)把細(xì)胞切開了,但對(duì)于胞核蛋白,建議還是通透一下,促進(jìn)抗體等試劑充分進(jìn)入?yún)⑴c反應(yīng)。

6、以上原因,都是針對(duì)實(shí)際中常見原因來進(jìn)行分析的,前提是排除操作者的操作錯(cuò)誤而引起陰性結(jié)果,這就需要新手還是要設(shè)置陽性對(duì)照以排除方法的問題。還有抗體稀釋液的PH值過低等其它原因的干擾。

總之,要想把免疫組化做好,可能每一個(gè)環(huán)節(jié)都很重要,但也存在主次之分,出現(xiàn)問題了,需要通過先排除主要的,再依次排除次要的--這是衡量你對(duì)免疫組化原理掌握與否的關(guān)鍵所在。

案例三:石蠟切片免疫熒光染色呈陰性結(jié)果或非特異性結(jié)果

背景:因?qū)嶒?yàn)需要,于2008年07月04日初次做肝臟組織ZO-1(一種胞膜蛋白,緊密連接蛋白)免疫熒光染色,以前我對(duì)酶免疫組化非常熟悉,在園子內(nèi)也有不少置頂貼和精華帖,但免疫熒光一直還沒做過(原理知道,但細(xì)節(jié)不太了解)。我先用石蠟切片做了5次,結(jié)果一直不理想(表現(xiàn)為未見特異性強(qiáng)染色);近幾日,我又切了冰凍切片,做了2次,終于基本成功了。在這個(gè)過程中,我對(duì)免疫熒光染色技術(shù)有了全新的認(rèn)識(shí),而前些天發(fā)出免疫熒光求助貼,回復(fù)的很少,所以有必要加強(qiáng)對(duì)免疫熒光方面的討論),不妥之處敬請(qǐng)指正。有人會(huì)問酶免疫組化做的好好的,為何要做免疫熒光?其實(shí),這也是我以前思考的難題,現(xiàn)在我認(rèn)為可能胞膜蛋白含量不高,用普通免疫免疫組化可能做不出來,需要敏感的免疫熒光方法來進(jìn)行蛋白檢測(cè)(我是看許多外文文獻(xiàn)都是這樣做的,因此選擇免疫熒光染色。)

問題及其解答:如何降低非特異性熒光染色和避免陰性著色?

1、非特異性染色產(chǎn)生原因及其解決方案:

(1)游離熒光素殘留在二抗中。一部分熒光素未與蛋白質(zhì)結(jié)合,形成了聚合物和衍化物,而不能被透析除去。二抗配置時(shí)用透析法或?qū)游龇ǚ蛛x熒光素標(biāo)記的二抗和游離的二抗。購(gòu)買高質(zhì)量、高純度的熒光素二抗。

(2)抗體以外的血清蛋白與熒光素結(jié)合形成熒光素脲蛋白,可與組織成分結(jié)合。

(3)組織抗原封閉不全。除去檢查的抗原以外,組織中還可能存在類屬抗原(如Forssman氏抗原),可與組織中特異性抗原以外之之相應(yīng)抗體結(jié)合。延長(zhǎng)血清封閉時(shí)間。

(4)從組織中難于提純抗原性物質(zhì),所以制備的免疫血清中往往混雜一些抗其他組織成分的抗體,以致容易混淆。

(5)抗體分子上標(biāo)記的熒光素分子太多,這種過量標(biāo)記的抗體分子帶過多的陰離子,可吸附于正常組織上而呈現(xiàn)非特異性染色。

(6)熒光素不純、標(biāo)本固定不當(dāng)?shù)取?/p>

(7)一抗和二抗孵育條件和濃度不合適。調(diào)整一抗和二抗孵育條件和濃度至*。

(8)一抗和二抗孵育后的清洗不充分。增加清洗次數(shù)和延長(zhǎng)清洗時(shí)間。

2、陰性染色產(chǎn)生的原因有:

(1)一抗和二抗?jié)舛炔缓线m或孵育條件不妥。

(2)熒光素提前衰退。熒光素質(zhì)量不佳或操作過程中沒有注意避光等防止熒光素衰退的事項(xiàng)。

(3)血清封閉時(shí)間過長(zhǎng)。

(4)抗體稀釋液PH值不合適,影響抗原抗體反應(yīng)。

(5)組織切片不平、裂片或脫片很嚴(yán)重,易引起大塊陰性著色。

(6)組織標(biāo)本不新鮮或已經(jīng)冷凍組織制成的切片中抗原易彌散,易引起本來表達(dá)的部位陰性染色或弱著色。

(7)熒光顯微鏡不會(huì)使用,激發(fā)波長(zhǎng)選擇錯(cuò)誤。

elisa試劑盒,進(jìn)口elisa試劑盒,國(guó)產(chǎn)elisa試劑盒,elisa試劑盒,明膠酶譜法試劑盒,白介素Elisa試劑盒,睪酮檢測(cè)試劑盒,雌二醇檢測(cè)試劑盒,進(jìn)口elisa試劑盒 -上海信帆生物科技有限公司

微信掃一掃

郵箱:1170233632@qq.com

傳真:021-51870610

地址:上海市顧戴路2988號(hào)B幢7樓

Copyright © 2024 上海信帆生物科技有限公司版權(quán)所有   備案號(hào):滬ICP備13019554號(hào)-1    技術(shù)支持:化工儀器網(wǎng)

TEL:13764793648

掃碼加微信