PRODUCT CLASSIFICATION
產(chǎn)品分類在細(xì)胞中,蛋白質(zhì)并不是孤單的個(gè)體。大多數(shù)蛋白通過與分子伴侶或其他蛋白形成復(fù)合物而發(fā)揮其功能。因此,在了解細(xì)胞的生物學(xué)特性時(shí),蛋白質(zhì)相互作用(PPI)研究就成了重要一環(huán)。在藥物開發(fā)的過程中,這一信息也至關(guān)重要,有助于確認(rèn)藥物靶點(diǎn)。
一提起蛋白質(zhì)相互作用研究,你的腦海中可能馬上浮現(xiàn)出:酵母雙雜交、免疫共沉淀等技術(shù)。的確,這些都是經(jīng)典方法,可有效檢測(cè)體內(nèi)體外蛋白質(zhì)相互作用。然而,它們不能提供動(dòng)態(tài)的蛋白相互作用信息,似乎還缺乏一些說服力?;诖?,共振能量轉(zhuǎn)移這種方法受到人們的青睞。這種能量轉(zhuǎn)移有著嚴(yán)格的距離限制(< 10 nm),特別適合評(píng)估蛋白質(zhì)的相互作用。
它的原理并不復(fù)雜,就是兩個(gè)蛋白分子靠近時(shí),激發(fā)態(tài)能量從一個(gè)熒光基團(tuán)轉(zhuǎn)移到另一個(gè)。生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移(BRET)和熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)都屬于這種方法。它們的主要區(qū)別在于,F(xiàn)RET涉及到兩個(gè)熒光基團(tuán)之間的能量轉(zhuǎn)移,其中一個(gè)需要適當(dāng)光源的外部激發(fā),而BRET在底物被氧化之后發(fā)生,因此不需要外部激發(fā)。如此看來,BRET相對(duì)FRET有不少優(yōu)點(diǎn),比如無需激發(fā)光,背景更低,也避免了光漂白和自發(fā)熒光等問題。
BRETzui初是在海洋生物中觀察到的,如水母和海腎。之后,人們將其用于動(dòng)物和植物研究。在BRET技術(shù)中,蛋白A融合螢光素酶(通常是海腎螢光素酶),作為能量供體,蛋白B則融合帶有熒光基團(tuán)的標(biāo)簽蛋白,作為能量受體。如果蛋白A和B存在相互作用,加入螢光素酶底物后,螢光素酶發(fā)光可以激發(fā)鄰近的蛋白B的熒光基團(tuán)發(fā)光。如果沒有相互作用,那就沒有熒光咯。
大幅改良的BRET平臺(tái)
目前,人們大多使用海腎螢光素酶(Rluc)作為能量供體,黃色熒光蛋白(YFP)作為能量受體,在這之間實(shí)現(xiàn)能量轉(zhuǎn)移。然而,Rluc和YFP的光譜接近,產(chǎn)生了明顯的背景。這種高背景增加了檢測(cè)噪音,也降低了靈敏度和動(dòng)態(tài)范圍。
于是,Promega對(duì)BRET方法進(jìn)行大幅改良。它使用NanoLuc® 螢光素酶作為能量供體,而HaloTag® 蛋白標(biāo)記的NanoBRET™ 618熒光基團(tuán)作為能量受體,帶來了的NanoBRET™ 技術(shù)。
集兩大于一身的NanoBRET™,可不是鬧著玩的。NanoLuc® 螢光素酶的分子量?jī)H為19 kDa(171個(gè)氨基酸),更適合于構(gòu)建融合蛋白。別看它小,它的光信號(hào)比海腎螢光素酶高兩個(gè)數(shù)量級(jí),因此極少量也能準(zhǔn)確定量,特別適合細(xì)胞水平蛋白相互作用的研究。
至于能量受體,Promega利用HaloTag® 蛋白標(biāo)簽技術(shù)來構(gòu)建。在評(píng)估了一系列熒光基團(tuán)之后,他們選擇了NanoBRET™ 618配基。它與NanoLuc® 的波長(zhǎng)配對(duì)更加,使得檢測(cè)數(shù)據(jù)更加出眾。于是,來自NanoLuc® 供體的明亮的藍(lán)移發(fā)光信號(hào)耦合到遠(yuǎn)紅移的HaloTag® 受體上后,光譜疊加更佳、信號(hào)更強(qiáng)、且與傳統(tǒng)的BRET分析相比背景更低。
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