PRODUCT CLASSIFICATION
產(chǎn)品分類實(shí)驗(yàn)原理:PCR擴(kuò)增是模擬天然DNA復(fù)制過(guò)程,利用DNA聚合酶在體外(試管中)擴(kuò)增一對(duì)引物之間特異性DNA片段的方法。其主要熱循環(huán)過(guò)程可分為三個(gè)步驟:
(1)高溫變性(denature):提供DNA復(fù)制的有效模板。
(2)低溫退火(anneal):引物與模板DNA復(fù)性,提供游離3’-OH端供DNA復(fù)制起始;
(3)中溫延伸(extend):依賴Mg2+,DNA聚合酶催化合成與模板互補(bǔ)的新的DNA分子。
以上變性、退火、延伸三個(gè)過(guò)程組成一個(gè)循環(huán)周期;常循環(huán)25~40周期,經(jīng)過(guò)n輪循環(huán)后,靶DNA的拷貝數(shù)理論上呈2n增長(zhǎng);循環(huán)進(jìn)行完畢,通常zui后還在DNA聚合酶zui適溫度下延伸5~10分鐘。
操作步驟:本次實(shí)驗(yàn)程序如下:
?。?)標(biāo)記一個(gè)潔凈的200uL反應(yīng)管,向其中依次加入:
ddH2O 36 uL
10×PCR反應(yīng)緩沖液 5uL
2mmol/L dNTPs 5uL
上游引物 1uL
下游引物 1uL
DNA模板 1uL
Taq DNA聚合酶 1 uL
總體積:50uL
混合均勻后,蓋緊管蓋,離心5S,使反應(yīng)成份均勻富集于管底。
(2) 加石蠟油50~100μl于反應(yīng)液表面以防蒸發(fā)(此步驟根據(jù)PCR儀而定,如帶高溫?zé)嵘wPCR儀不需加入)。
(3) 在PCR儀上設(shè)置反應(yīng)循環(huán)參數(shù),本次實(shí)驗(yàn)為:94℃ 30s,56℃ 30s,72℃ 30s,循環(huán)數(shù)為30,zui后于72℃充分延伸10 min后終止反應(yīng)(16℃ 3 min)。
(4) 置反應(yīng)管于PCR儀上進(jìn)行熱循環(huán)。
?。?) 反應(yīng)完畢后,常取5~10%反應(yīng)產(chǎn)物(如本次5uL)進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,通過(guò)溴乙錠染色,在紫外燈下觀察擴(kuò)增產(chǎn)物的質(zhì)量,正常DNA電泳帶應(yīng)清晰、整齊,并通過(guò)與已知分子量大小的DNA標(biāo)志物比較,初步了解產(chǎn)物大小是否與預(yù)期吻合。
注意事項(xiàng):
1. 戴手套操作,避免污染
2.冰上操作
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