信帆生物代理銷售ELISPOT試劑盒，解析其原理、步驟和發(fā)展！

在免疫學(xué)領(lǐng)域中，對于疾病以及疫苗研究不僅僅局限于體液免疫應(yīng)答(B細胞免疫)，細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答(cell mediated immune response，CMI)也是人們所關(guān)注的，而T細胞在CMI中起關(guān)鍵作用。在研究免疫應(yīng)答機制時以往常用用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測體液中游離的細胞因子(CK)或抗體，但由于游離的循環(huán)抗體或CK的半哀期不同，使之在體液中不斷的被代謝或與靶器官結(jié)合，而不能確切的反映體內(nèi)的抗體及CK的水平。 80 年代，國外的科研工作者根據(jù) ELISA 技術(shù)的基本原理，建立了體外檢測特異性抗體分泌細胞和 CK 分泌細胞的固相酶聯(lián)免疫斑點技術(shù)( ELISPOT )。作為一項新型的免疫酶技術(shù)——酶聯(lián)免疫斑點法(enzyme linked immunospot assay，ELISPOT)，是從單細胞水平檢測分泌抗體細胞(ASC) 或分泌細胞因子(CK) 細胞的一項細胞免疫學(xué)檢測技術(shù)。由于該方法具有較高的特異性和敏感性，易操作，成本相對流式細胞分析術(shù)也較低，已被廣泛用于分泌CK細胞檢測或ASC測定中，對探索自身免疫系統(tǒng)疾病發(fā)病機制具有重要意義。

Elispot 法源自 ELISA，又突破傳統(tǒng) ELISA 法，是定量 ELISA 技術(shù)的延伸和新的發(fā)展。兩者都是檢測細胞產(chǎn)生的細胞因子或其他可溶性蛋白，它們zui大的不同在于：

(1) elisa通過顯色反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上測定吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較得出可溶性蛋白總量。

(2) ELISPOT也是通過顯色反應(yīng)，在細胞分泌這種可溶性蛋白的相應(yīng)位置上顯現(xiàn)清晰可辨的斑點，可直接在顯微鏡下人工計數(shù)斑點或通過ELISPOT 分析系統(tǒng)對斑點進行計數(shù)，1個斑點代表1個細胞，從而計算出分泌該蛋白的細胞的頻率。(某些研究不僅要測細胞因子生成量，還需檢測分泌此細胞因子的細胞頻率)

由于是單細胞水平檢測， ELISPOT 比 ELISA 和有限稀釋法等更靈敏，能從20萬-30萬細胞中檢出1個分泌該蛋白的細胞。捕獲抗體為高親和力、高特異性、低內(nèi)毒素單抗，在研究者以刺激劑激活細胞時，不會影響活化細胞分泌細胞因子。

原理

ELISPOT就其原理來說實在是很簡單的，從本質(zhì)上說和ELISA的原理是一樣的，理解起來并不難。細胞受到刺激后局部產(chǎn)生細胞因子，此細胞因子被特異單克隆抗體捕獲。細胞分解后，被捕獲的細胞因子與生物素標(biāo)記的二抗結(jié)合，其后再與堿性磷酸酶標(biāo)記的親和素結(jié)合。BCIP/NBT 底物孵育后，PVDF孔板出現(xiàn)“紫色”的斑點表明細胞產(chǎn)生了細胞因子，通過ELISPOT 酶聯(lián)斑點分析系統(tǒng)對斑點的分析后得出結(jié)果。傳統(tǒng)的ELISA與ELISPOT都是根據(jù)酶免疫學(xué)檢測原理，通過酶的高催化頻率，放大反應(yīng)效果，從而達到很高敏感度的檢測效果。

ELISPOT全名為enzyme-linked Immunospot Assay，其技術(shù)原理與ELISA相似。其實驗設(shè)計是在96微孔培養(yǎng)盤底部披覆PVDF薄膜，用來吸附特殊挑選、且無毒性(不含sodium azide、內(nèi)毒素endotoxin)的單株抗體。靜脈血PBMC細胞經(jīng)適當(dāng)分離處理后，會被分配到微孔盤上，再接受適當(dāng)?shù)目乖碳?，并將微孔盤放置于溫箱中過一夜培養(yǎng)一段時間。一般而言，記憶型T細胞在受抗原刺激數(shù)小時后會開始分泌細胞激素，此時局部(在緊靠分泌細胞的周圍)分泌出的細胞激素會被 PVDF薄膜上特異抗體捕獲。微孔盤中的細胞被移除并清洗后，被捕獲的細胞激素可進一步使用生物素(Biotin)標(biāo)記的二次抗體來標(biāo)志，其后再以結(jié)合酵素的StreptAvidin與之作用，并加入酵素受質(zhì)使其呈色，有反應(yīng)作用的細胞會留下染色斑點。

反應(yīng)步驟可大致分為：

(1) 利用特定細胞因子的單克隆抗體包被96孔板，封閉剩余的空白位點;

(2) 加入細胞懸液，用特異性抗原刺激、活化細胞，產(chǎn)生細胞因子，細胞因子會往附近擴散與之前包被的抗體進行特異結(jié)合;

(3) 洗掉細胞;

(4) 加入酶標(biāo)二抗特異與細胞因子進行結(jié)合，通過底物的顯色反應(yīng)，一個細胞所在位置就會顯出斑點，zui后利用顯微鏡或者特定的讀板機(reader)就可以計算出樣品中被激活細胞的數(shù)目。

以上是檢測分泌細胞因子細胞的流程，如果是檢測分泌特異抗體的細胞只需把包被特異抗體變?yōu)榘惶禺惪乖纯伞?/p>

ELISPOT技術(shù)的發(fā)展

(1) ELISPOT技術(shù)的過去

ELISPOT是20多年前便己研發(fā)成功的老技術(shù)。Czerkinsky 等人在1983年，運用該技術(shù)成功地檢測出因受激而分泌抗體的B細胞頻率。從那時起世界各國免疫學(xué)者便開始一長期的ELISPOT Cytokine技術(shù)競賽，每個團隊都希望能將此一技術(shù)推廣來研究T細胞免疫，其絕妙之處在提供一接近體內(nèi)實驗的環(huán)境，藉由偵測T細胞分泌的各類細胞因子，來定量機體內(nèi)免疫反應(yīng)啟始者Precursor T的clonal size族群大小，同時預(yù)測體內(nèi)免疫系統(tǒng)即將進行的下游免疫反應(yīng)。

ELISPOT Cytokine技術(shù)雖說操作簡單，但該技術(shù)并沒能如預(yù)期地很快地被成功應(yīng)用在ex vivo T細胞功能研究。要讓ELISPOT技術(shù)從B細胞免疫走向T細胞免疫的產(chǎn)生的*個主要問題，便是靈敏度的提升，因為T細胞因子較之B細胞免疫球蛋白產(chǎn)量極少。早期ELISPOT的分析條件不是非常理想，成對抗體的品質(zhì)、呈色底膜的材質(zhì)等幾個技術(shù)性的問題，使當(dāng)時多數(shù)研究團隊很難獲得清晰的斑點，結(jié)果是敏感度不夠、數(shù)據(jù)分析重現(xiàn)性低。這問題直到1996美國俄亥俄卅Case Western Reserve大學(xué)Paul Lehmann團隊引進PVDF薄膜的應(yīng)用(Forsthuber et al., Science, 1996)，才釜底抽薪地解決了該技術(shù)因斑點呈色問題造成低敏感度的缺失。與原來的標(biāo)準(zhǔn)膜面相比，PVDF薄膜提供1,000倍的較大面積來吸附單株抗體，使T細胞分泌的各類細胞因子能在細胞周圍就近被俘虜，讓呈色斑點集中、清晰、對比色高，大大的提高ELISPOT Cytokine分析的敏感度。圖一是使用PVDF-BASED改良薄膜(Panel A)與傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)薄膜(Panel B)并行實驗的比較結(jié)果。同樣的人體 PBMC樣品，在通過*相同的實驗，Panel A呈現(xiàn)較清晰的小色點。

第二個技術(shù)性問題是ELISPOT Cytokine實驗分析的幾個基本假設(shè)缺乏科學(xué)實證，也使得該技術(shù)在當(dāng)時并沒受到該有的廣泛重視。沒有科研人員嘗試去厘清一些基礎(chǔ)但很重要的問題，諸如;

實驗所得的斑點是抗原特定T細胞所生物試劑，還是旁觀細胞受Cytokine刺激的次級效應(yīng)?

斑點的小或大有何生理意義;如何決定cutoff值?

能否相信斑點是由單一的細胞造成?

ELISPOT Cytokine分析技術(shù)能準(zhǔn)確測量的頻率范圍?

如果效應(yīng)相互拮抗的cytokine同時產(chǎn)生，它們是否會互相妨礙?及到什么程度?

(2) ELISPOT 技術(shù)的現(xiàn)在

1996年以來隨著抗體制備、PVDF膜材篁等技術(shù)改良，ELISPOT 分析技術(shù)已經(jīng)逐漸達到科研人員的期待，它已是當(dāng)世*zui靈敏抗原特定T細胞的體外檢測技術(shù)。藉由檢驗新鮮分離PBMC細胞所分泌cytokine的指紋，ELISPOT 分析技術(shù)可提示T細胞免疫系統(tǒng)的兩個重要參數(shù)：抗原特定T細胞的clone族群大小;和免疫效應(yīng)細胞的信號傳導(dǎo)路徑Th1/Th2。

多年來經(jīng)過數(shù)十個研究團隊的致力研究，對于ELISPOT分析技術(shù)本身的幾個問題，也有了科學(xué)上的驗證。目前一般*，ELISPOT技術(shù)允許科研人員在單細胞水平上識別抗原特定T細胞，主要針對經(jīng)由CD4或者CD8細胞的免疫反應(yīng)。在適當(dāng)?shù)膶嶒炘O(shè)計下，ELISPOT Cytokine 斑點的數(shù)量分析顯示斑點是由一個單細胞所生成，同時斑點形態(tài)學(xué)與Time Response分析則顯示斑點直徑大小直接反映該細胞族群的產(chǎn)能。也因為如此，ELISPOT是個免疫學(xué)上的標(biāo)竿技術(shù)，它可以允許科研人員在幾乎自然生理條件下，觀察細胞實際分泌Cytokine的進程，進而可以得到藥理學(xué)信息，闡明免疫調(diào)節(jié)藥物如何影響T細胞分泌各類cytokine的速率。藥物抑制 T細胞免疫一般可通過兩程截然不同的機轉(zhuǎn);使能分泌Cytokine的Precursor T細胞族群變小，或減少每Precursor T細胞的cytokine產(chǎn)能，而ELISPOT技術(shù)能提供雙份信息。

ELISPOT分析技術(shù)的幾個特點已經(jīng)讓它在抗原特定T細胞免疫學(xué)上*。此技術(shù)是當(dāng)世*準(zhǔn)許百萬分之一1:1000,000的準(zhǔn)確分析，如此強效的解析力使流式細胞技術(shù)也望其項背，以目前國內(nèi)外常規(guī)的 intracellular cytokine或者Dimer/ tetramer染色，流式技術(shù)的靈敏度一般限制在1:10,000。這樣的高靈敏度對T細胞免疫學(xué)研究是必須的，因為抗原特定T細胞一般在機體周邊循環(huán)系統(tǒng)發(fā)生的頻率通常低于萬中取一。此外由于ELISPOT Cytokine技術(shù)被證實適用于冰凍后復(fù)蘇的人類淋巴球，解凍后PMBC與新鮮分離樣品有相當(dāng)?shù)男r，沒有喪失功能。這一點對研究試驗非常重要，它使科研人員得以并行分析免疫治療前、后的樣本血樣，如果試驗牽涉全國多個研究試驗機構(gòu)，樣本血樣可冰存并同時集中在「中央實驗室」一齊被測試。同理，一個血樣或標(biāo)準(zhǔn)對照品可被分裝小份，被送到不同檢驗中心進行測試，以交互比對，同時有利LISPOT Cytokine技術(shù)流程的規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化。

(3) ELISPOT 未來展望

ELISPOT 分析技術(shù)正在歐美各國發(fā)揮它的完整潛能，它讓免疫學(xué)家可以直接洞察活體內(nèi)T細胞相關(guān)生理學(xué)或病理學(xué)，就像是心臟外科醫(yī)師手上的那張心電圖，經(jīng)由這個技術(shù)科研人員可以在活體內(nèi)直接進入一個器官系統(tǒng)，在那里視察、發(fā)掘，得到全新的智識。

從各國文獻可見ELISPOT技術(shù)已經(jīng)達到標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化的要求，并被廣泛地應(yīng)用在多項領(lǐng)域，包括監(jiān)視癌癥樣本接受免疫療程時的反應(yīng)(Lewis, 2000 and Janetzki, 2000)，以及感染性疾病(Moss, 2000, Rahman, 2000, Rowland-Jones, 1998, Herr, 1997 and Lechner, 2000)、腫瘤(Nagorsen, 2000)、或自體免疫樣本體內(nèi)的一個特定的免疫反應(yīng)型式(Pelfrey, 2000)。ELISPOT技術(shù)同時也在數(shù)個疫苗效價評估人體試驗中，被當(dāng)成重要的終結(jié)指針。2003年1月，世界衛(wèi)生組織通過與大陸北京性艾中心合作，將應(yīng)用ELISPOT技術(shù)來監(jiān)測HIV疫苗研究免疫應(yīng)答反應(yīng)技術(shù)，該計劃將是利用ELISPOT技術(shù)對亞洲國家從事HIV疫苗研究和研究試驗的有關(guān)研究。我們期待未來此一技術(shù)能在我國免疫學(xué)界得到廣泛地應(yīng)用。