PRODUCT CLASSIFICATION
產(chǎn)品分類信帆生物為大家提供:Western blot實(shí)驗(yàn)步驟詳解
一.實(shí)驗(yàn)步驟
1. 組織塊稱重
2. 利用液氮、研缽粉碎組織塊
3. 加入RIPA緩沖液(每克組織3 ml RIPA),PMSF(每克組織30μl,10 mg/ml PMSF),利用Polytron進(jìn)一步勻漿(15,000轉(zhuǎn)/分*1分鐘)維持4℃
4. 加入PMSF(每克組織30μl,10 mg/ml PMSF),冰上孵育30分鐘
5. 移入離心管4℃ 約20,000 g(約15,000轉(zhuǎn))15分鐘
6. 上清液為細(xì)胞裂解液可分裝-20℃保存
7. 進(jìn)行Bradford比色法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度
8. 取相同質(zhì)量的細(xì)胞裂解液(體積*蛋白質(zhì)濃度),并加等體積的2×電泳加樣緩沖液
9. 沸水浴中3分鐘
10. 上樣
11. 電泳(濃縮膠20mA,分離膠35mA)
12. 電轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜(100mA 40分鐘)
13. 膜用麗春紅染色,膠用考馬斯亮藍(lán)染色
14. Westernblot 試劑盒顯色
15. 分析比較記錄
western blot的實(shí)驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng)的資料
1. 把聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質(zhì)電泳轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上。
1)轉(zhuǎn)移緩沖液洗滌凝膠和硝酸纖維素膜,將硝酸纖維素膜鋪在凝膠上,用5ml移液管在凝膠上來(lái)回滾動(dòng)去除所有的氣泡。
2)在凝膠/濾膜外再包一張3mm濾紙(預(yù)先用轉(zhuǎn)移緩沖液浸濕),將凝膠夾在中間,保持濕潤(rùn)和沒(méi)有氣泡。
3)將此濾紙/凝膠/薄膜濾紙按照廠家建議方法放入電泳裝置中,凝膠面向陰極。
4)將上述裝置放入緩沖液槽中,并灌滿轉(zhuǎn)移緩沖液以淹沒(méi)凝膠。
5)按照廠家所示接通電源開(kāi)始電泳轉(zhuǎn)移。
6)轉(zhuǎn)移結(jié)束后,取出薄膜和凝膠,棄去凝膠。
2. 將薄膜漂在氨基黑中快速染色,直至分子量標(biāo)準(zhǔn)顯現(xiàn)時(shí)取出,記錄下標(biāo)準(zhǔn)位置。
3. 用100ml水洗滌纖維素膜,必要時(shí)可用脫色緩沖液。
4. 膜置印跡緩沖液中于37℃保溫1小時(shí)。
5. 室溫下,用PBS-Tween緩沖液洗滌薄膜。
6. 用封口機(jī)將薄膜封入塑料袋中,盡可能不留空氣。
7.袋的一角剪一緩沖液的小口,用透析袋夾緊。
8.混合:NGS(100微升),印跡緩沖液中的抗體(10毫升),加在裝薄膜的袋中,于室溫下?lián)u動(dòng)2小時(shí)(或4℃過(guò)一夜)
9.用總體積300ml PBS-Tween緩沖液,分4次在一淺盤(pán)中洗滌薄膜,每次75ml。
10. 將連接生物素的羊抗兔IgG(40微升溶于10毫升印跡緩沖液/100微升 NGS)加在袋內(nèi),于室溫下?lián)u動(dòng)1小時(shí)。
11.按步驟9洗滌。
12.加入抗生素蛋白-HRP(40微升溶于10毫升印跡緩沖液/100微升 NGS),于室溫下?lián)u動(dòng)。
注意事項(xiàng):
western blot中轉(zhuǎn)移在膜上的蛋白處于變性狀態(tài),空間結(jié)構(gòu)改變,因此那些識(shí)別空間表位的抗體不能用于western blot檢測(cè)。這種情況可以將表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞或細(xì)胞裂解液中的所有蛋白物素化,再用酶標(biāo)記親和素進(jìn)行western blot。實(shí)驗(yàn)中取膠和膜需帶手套。
Western可以參考如下步驟進(jìn)行操作。
1.收集蛋白樣品(Protein sample preparation)
可以使用適當(dāng)?shù)牧呀庖海绫淘铺焐镌噭┑腤estern及IP細(xì)胞裂解液,裂解貼壁細(xì)胞、懸浮細(xì)胞或組織樣品。對(duì)于某些特定的亞細(xì)胞組份蛋白,例如細(xì)胞核蛋白、細(xì)胞漿蛋白、線粒體蛋白等,可以參考相關(guān)文獻(xiàn)提取這些亞細(xì)胞組份蛋白,也可以使用試劑盒進(jìn)行抽提,例如碧云天生物試劑的細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒。收集完蛋白樣品后,為確保每個(gè)蛋白樣品的上樣量一致,需要測(cè)定每個(gè)蛋白樣品的蛋白濃度。根據(jù)所使用的裂解液的不同,需要采用適當(dāng)?shù)牡鞍诐舛葴y(cè)定方法。因?yàn)椴煌牡鞍诐舛葴y(cè)定方法對(duì)于一些去垢劑和還原劑等的兼容性差別很大。如果使用碧云天生物試劑的Western及IP細(xì)胞裂解液,可以使用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒。
2. 電泳(Electrophoresis)
(1) SDS-PAGE凝膠配制
SDS-PAGE凝膠可以參考一些文獻(xiàn)資料進(jìn)行配制,也可以使用碧云天生物試劑的SDS-PAGE凝膠配制試劑盒。該試劑盒提供了除水和配膠器具外的所有試劑以及配制各種濃度SDS-PAGE的配方。
(2) 樣品處理
在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液可以減小上樣體積,在相同體積的上樣孔內(nèi)可以上樣更多的蛋白樣品。5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液可以參考相關(guān)文獻(xiàn)資料配制,也可以使用碧云天生物試劑的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5X)。
100℃或沸水浴加熱3-5分鐘,以充分變性蛋白.
(3) 上樣與電泳
冷卻到室溫后,把蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)即可。為了便于觀察電泳效果和轉(zhuǎn)膜效果,以及判斷蛋白分子量大小,使用預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)。
電泳時(shí)通常推薦在上層膠時(shí)使用低電壓恒壓電泳,而在溴酚藍(lán)進(jìn)入下層膠時(shí)使用高電壓恒壓電泳。對(duì)于Bio-Rad的標(biāo)準(zhǔn)電泳裝置或類似電泳裝置,低電壓可以設(shè)置在80-100V,高電壓可以設(shè)置在120V左右。SDS-PAGE可以采用普通的電泳儀就可以滿足要求,也可以采用碧云天的多功能電泳儀(帶定時(shí))。為了電泳方便起見(jiàn),也可以采用整個(gè)SDS-PAGE過(guò)程恒壓的方式,通常把電壓設(shè)置在100V,然后設(shè)定定時(shí)時(shí)間為90-120分鐘。設(shè)置定時(shí)可以避免經(jīng)常發(fā)生的電泳過(guò)頭。通常電泳時(shí)溴酚藍(lán)到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳,或者可以根據(jù)預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)的電泳情況,預(yù)計(jì)目的蛋白已經(jīng)被適當(dāng)分離后即可停止電泳。
3. 轉(zhuǎn)膜(Transfer)
我們推薦在Western實(shí)驗(yàn)中選用PVDF膜。硝酸纖維素膜(NC膜)也可以使用,但硝酸纖維素膜比較脆,在操作過(guò)程中特別是用鑷子夾取等過(guò)程中容易裂開(kāi)。膜的使用請(qǐng)參考生物試劑商的推薦使用步驟。
通常如果使用Bio-Rad的標(biāo)準(zhǔn)濕式轉(zhuǎn)膜裝置,可以設(shè)定轉(zhuǎn)膜電流為300-400mA,轉(zhuǎn)膜時(shí)間為30-60分鐘。也可以在15-20mA轉(zhuǎn)膜過(guò)一夜。轉(zhuǎn)膜時(shí)也可以使用碧云天的多功能電泳儀(帶定時(shí))。具體的轉(zhuǎn)膜時(shí)間要根據(jù)目的蛋白的大小而定,目的蛋白的分子量越大,需要的轉(zhuǎn)膜時(shí)間越長(zhǎng),目的蛋白的分子量越小,需要的轉(zhuǎn)膜時(shí)間越短。
在轉(zhuǎn)膜過(guò)程中,特別是高電流快速轉(zhuǎn)膜時(shí),通常會(huì)有非常嚴(yán)重的發(fā)熱現(xiàn)象,把轉(zhuǎn)膜槽放置在冰浴中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。
轉(zhuǎn)膜的效果可以觀察所使用的預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn),通常分子量zui大的1-2條帶較難全部轉(zhuǎn)到膜上。轉(zhuǎn)膜的效果也可以用麗春紅染色液對(duì)膜進(jìn)行染色,以觀察實(shí)際的轉(zhuǎn)膜效果。也可以用考馬斯亮藍(lán)快速染色液對(duì)完成轉(zhuǎn)膜的SDS-PAGE膠進(jìn)行染色,以觀察蛋白的殘留情況。
4. 封閉(Blocking)
轉(zhuǎn)膜完畢后,立即把蛋白膜放置到預(yù)先準(zhǔn)備好的Western洗滌液中,漂洗1-2分鐘,以洗去膜上的轉(zhuǎn)膜液。從轉(zhuǎn)膜完畢后所有的步驟,一定要注意膜的保濕,避免膜的干燥,否則極易產(chǎn)生較高的背景。
用微型臺(tái)式真空泵吸盡洗滌液,加入Western封閉液,在搖床上緩慢搖動(dòng),室溫封閉60分鐘。對(duì)于一些背景較高的抗體,可以在4℃ 封閉過(guò)一夜。在整個(gè)Western過(guò)程中我們推薦使用碧云天生物試劑的側(cè)擺搖床,側(cè)向擺動(dòng)速度比較緩慢,而且也容易讓溶液覆蓋蛋白膜。
5. 一抗孵育(Primary antibody incubation)
參考一抗的說(shuō)明書(shū),按照適當(dāng)比例用Western一抗稀釋液稀釋一抗。
用微型臺(tái)式真空泵吸盡封閉液,立即加入稀釋好的一抗,室溫或4℃在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)孵育一小時(shí)。如果一抗孵育一小時(shí)效果不佳,可以在4℃緩慢搖動(dòng)孵育過(guò)一夜。
回收一抗。加入Western洗滌液,在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)洗滌5-10分鐘。吸盡洗滌液后,再加入洗滌液,洗滌5-10分鐘。共洗滌3次。如果結(jié)果背景較高可以適當(dāng)延長(zhǎng)洗滌時(shí)間并增加洗滌次數(shù)。
6. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation)
參考二抗的說(shuō)明書(shū),按照適當(dāng)比例用Western二抗稀釋液稀釋辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗。用微型臺(tái)式真空泵吸盡洗滌液,立即加入稀釋好的二抗,室溫或4℃在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)孵育一小時(shí)。
回收二抗。加入Western洗滌液,在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)洗滌5-10分鐘。吸盡洗滌液后,再加入洗滌液,洗滌5-10分鐘。共洗滌3次。如果結(jié)果背景較高可以適當(dāng)延長(zhǎng)洗滌時(shí)間并增加洗滌次數(shù)。
7. 蛋白檢測(cè)(Detection of proteins)
參考相關(guān)說(shuō)明書(shū),使用BeyoECL, Western 熒光檢測(cè)試劑等ECL類試劑來(lái)檢測(cè)蛋白。
洗片時(shí)可以使用X光片自動(dòng)洗片機(jī)。如果沒(méi)有自動(dòng)洗片機(jī),可以用顯影定影試劑盒自行配制顯影液和定影液進(jìn)行手工洗片。
8. 膜的重復(fù)利用(Membrane recovery)
如果蛋白樣品非常寶貴,可以使用Western一抗二抗去除液處理蛋白膜,以重復(fù)利用蛋白膜。
郵箱:1170233632@qq.com
傳真:021-51870610
地址:上海市顧戴路2988號(hào)B幢7樓