血液透析是慢性腎功能衰竭(CRF)的替代治療方法之一,營(yíng)養(yǎng)不良、動(dòng)脈粥樣硬化、淀粉樣變、感染等是維持性血液透析(MHD)常見(jiàn)并發(fā)癥,發(fā)生率高,是影響患者生活質(zhì)量和存活率的重要因素.目前認(rèn)為,在透析相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展中,MHD患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中促炎癥介質(zhì)白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNFα)等異常高表達(dá)起著關(guān)鍵作用,降低其表達(dá)可降低血液透析相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生率,減輕其嚴(yán)重程度,延緩其發(fā)展；核因子-κB(Nuclearfactor-κB,NF-κB)是序列特異的轉(zhuǎn)錄因子,對(duì)IL-6、TNFα等促炎癥介質(zhì)基因和蛋白質(zhì)的表達(dá)起關(guān)鍵的調(diào)控作用.因此,研究MHD患者NF-κB信號(hào)途徑的活化狀態(tài),及其在TNFα和IL-6表達(dá)中的作用將有助于深入探討MHD患者血液透析相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制和探索有效的治療方法.
   為此,本文將從下列幾個(gè)方面對(duì)其進(jìn)行研究:（1）觀察MHD患者透析前PBMCTNFα和IL-6表達(dá)水平及其對(duì)脂多糖(LPS)刺激的反應(yīng)性；（2）觀察MHD患者透析前PBMC NF-κB活化水平,及其與TNFα和IL-6表達(dá)的關(guān)系,觀察NF-κB特異性抑制劑吡咯啉烷二甲基硫脲(PDTC)對(duì)PBMC NF-κB活化及TNFα、IL-6表達(dá)的影響,探討NF-κB在MHD患者PBMC TNFα和IL-6表達(dá)中的作用；（3）在單次血液透析中,觀察二醋酸纖維素膜（CDA膜）和聚砜膜（PS膜）MHD患者血液透析前后PBMC NF-κB活性水平的變化,及NF-κB信號(hào)途徑對(duì)透析4h后PBMC TNFα和IL-6表達(dá)的影響,探討不同透析膜對(duì)MHD患者PBMC NF-κB信號(hào)途徑活性的影響及意義.
   一、MHD患者透析前PBMC TNFα和IL-6表達(dá)水平的觀察
   研究對(duì)象為使用同種膜材料透析器超過(guò)6個(gè)月的MHD患者26例,其中CDA膜15例,PS膜11例,碳酸氫鹽透析,每次4h,每周3次,血流量200～280 ml/min,透析液流量500ml/min；健康志愿者10例,尚未行腎臟替代治療的CRF患者12例（非透析CRF組）.采外周血25mL,梯度密度離心法制備新鮮PBMC,5％新生牛血清RPMI1640培養(yǎng)（5％〓、37℃）,培養(yǎng)分組為:（1）LPS刺激組（LPS終濃度為1mg/L,LPS組）；（2）單純含5％新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基（單純培養(yǎng)組）.血漿和PBMC培養(yǎng)上清液IL-6和TNFα采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定,培養(yǎng)PBMC IL-6和TNFαmRNA采用半定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)法檢測(cè),血C-反應(yīng)蛋白(CRP)水平采用免疫濁度法測(cè)定.結(jié)果顯示:（1）單純培養(yǎng)基培養(yǎng)下,健康人、非透析CRF、CDA膜和PS膜組患者PBMC培養(yǎng)上清液IL-6含量分別為4.67、5.79、6.55和6.28(ng/mL),TNFα含量分別為475.7、545.7、654.5和641.4(pg/mL),IL-6mRNA表達(dá)量分別為0.12、0.21、0.35和0.33（吸光度A值）,TNFαmRNA表達(dá)量分別為0.66、0.85、1.14和1.09（吸光度A值）,上述結(jié)果比較,PS膜組和CDA組MHD患者PBMC IL-6、TNFαmRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)均高于健康人和非透析CRF患者（P<0.05）,PS膜組與CDA膜組間比較差異沒(méi)有顯著性（P>0.05）,非透析CRF患者高于健康人（P<0.05）.（2）LPS刺激下,健康人、非透析CRF、CDA膜和PS膜組患者PBMC IL-6、TNFα蛋白質(zhì)和mRNA表達(dá)均高于單純培養(yǎng)組（P<0.01）,且PS膜組和CDA膜組患者高于健康人和非透析CRF患者（P<0.05）,PS膜組與CDA膜組間差異沒(méi)有顯著性（P>0.05）.（3）健康人、非透析CRF、MHD患者血漿IL-6濃度分別為16.7、26.2、25.6和26.8（pg/mL）,TNFα濃度分別為42.9、56.3、58.6和54.1（pg/mL）,非透析CRF、CDA膜和PS膜組患者血漿IL-6和TNFα濃度均高于健康人（P<0.05）,它們?nèi)唛g差異沒(méi)有顯著性（P>0.05）.（4）CDA膜和PS膜組患者血CRP水平高于健康人和非透析CRF患者（P<0.05）,PS膜與CDA膜組間差異沒(méi)有顯著性（P>0.05）；CDA膜和PS膜組患者血漿白蛋白水平低于健康人（P<0.05）.（5）相關(guān)分析顯示,MHD患者PBMC TNFαmRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)與血CRP水平呈正相關(guān)（r=0.61和r=0.68,P<0.05）,與血漿白蛋白呈負(fù)相關(guān)（r=-0.57和r=-0.62,P<0.05）；IL-6 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)與血CRP水平呈正相關(guān)(r=0.66和r=0.71,P<0.05）,與血漿白蛋白呈負(fù)相關(guān)（r=-0.66和r=-0.53,P<0.05）.
   結(jié)果提示,MHD患者透析前即存在PBMC TNFα、IL-6 mRNA和蛋白質(zhì)異常高表達(dá),PBMC對(duì)LPS的反應(yīng)性也明顯增高；MHD患者PBMC TNFα、IL-6 mRNA和蛋白質(zhì)異常高表達(dá)與血CRP水平呈正相關(guān),與血漿白蛋白呈負(fù)相關(guān).
   二、MHD患者透析前PBMC NF-κB活性水平觀察及其對(duì)TNF-α和IL-6表達(dá)的影響
   研究對(duì)象同*部分.采外周血25mL,梯度密度離心法制備新鮮PBMC,5％新生牛血清RPMI1640培養(yǎng)24h,分別加入:（1）終濃度為1mg/L的LPS（LPS組）；（2）終濃度為100pmol/mL的PDTC（PDTC組）；（3）先加入終濃度為100pmol/mL的PDTC培養(yǎng)10min,然后加入終濃度為1mg/L的LPS（LPS+PDTC組）；（4）單純含5％新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基（單純培養(yǎng)組）.RT-PCR法檢測(cè)PBMC IL-6和TNFα mRNA,ELISA法測(cè)定培養(yǎng)上清液IL-6和TNFα,電泳遷移率改變實(shí)驗(yàn)(EMSA)及圖象分析技術(shù)測(cè)定NF-κB活性.結(jié)果發(fā)現(xiàn),（1）單純培養(yǎng)基培養(yǎng)下,健康人、非透析CRF、CDA膜和PS膜組患者PBMC NF-κB活性分別為0.30、0.53、0.77和0.74（吸光度A值）,CDA膜組和PS膜組MHD患者高于健康人和非透析CRF患者（P<0.05）,CDA膜組與PS膜組間差異沒(méi)有顯著性（P>0.05）,非透析CRF患者高于健康人（P<0.05）；LPS刺激下,健康人、非透析CRF、CDA膜和PS膜組患者PBMC NF-κB活性分別為1.17、1.95、2.24和2.17（吸光度A值）,均高于單純培養(yǎng)時(shí)（P<0.01）,且PS膜組和CDA膜組患者高于健康人和非透析CRF患者（P<0.05）,PS膜組與CDA膜組間差異沒(méi)有顯著性（P>0.05）,非透析CRF患者高于健康人（P<0.05）.（3）在健康人、非透析CRF、CDA膜和PS膜組患者,NF-κB特異性抑制劑PDTC顯著抑制單純培養(yǎng)基培養(yǎng)或LPS刺激的PBMC NF-κB活性（P<0.01）,同時(shí),明顯抑制TNFα、IL-6 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)（P<0.01）.（4）MHD患者PBMC NF-κB活性與血漿IL-6、TNFα水平呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為r=0.75和r=0.69（P<0.05）；與PBMC IL-6 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.65和r=0.85,P<0.05）,與PBMC TNFαmRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)也呈正相關(guān)（r=0.75和r=0.63,P<0.05）.
   上述結(jié)果提示,在單純培養(yǎng)下,MHD患者透析前PBMC NF-κB信號(hào)途徑呈高度活化,且與IL-6、TNFαmRNA和蛋白質(zhì)異常高表達(dá)呈正相關(guān)；MHD患者PBMC NF-κB容易被LPS等刺激因素活化；PDTC可阻抑NF-κB活化,同時(shí),顯著抑制MHD患者PBMC IL-6、TNFαmRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)；我們認(rèn)為,NF-κB信號(hào)途徑可能在MHD患者透析前PBMC IL-6和TNFα異常高表達(dá)中起重要作用.
   三、NF-κB對(duì)血液透析中PBMC TNFα和IL-6表達(dá)的影響
   研究對(duì)象、材料和方法同第二部分.結(jié)果發(fā)現(xiàn):（1）血液透析4h后,CDA膜組患者PBMC NF-κB活性明顯高于透析前（0.83 vs 0.77,A值,P<0.01）,培養(yǎng)上清液IL-6含量明顯高于透析前（7.03 vs 6.55ng/mL,P<0.05）,TNFα含量明顯高于透析前（706.7 vs 654.5pg/mL,P<0.01）,IL-6 mRNA表達(dá)明顯高于透析前（0.46vs 0.35,A值,P<0.01）,TNFαmRNA表達(dá)明顯高與透析前（1.23 vs 1.14,A值,P<0.01）,PS膜組患者透析前后PBMC NF-κB活性分別為0.74 vs 0.79（A值）,差異沒(méi)有顯著性（P>0.05）,透析前后IL-6 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)分別為0.32 vs 0.36（A值）和6.28vs6.44（ng/mL）,差異沒(méi)有顯著性（P>0.05）,TNFαmRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)分別為1.09vs 1.14（A值）和641.4 vs 661.5（pg/mL）,差異沒(méi)有顯著性（P>0.05）.（2）血液透析4h后,PDTC（100pmol/mL）對(duì)單純培養(yǎng)和LPS刺激下的PBMC NF-κB活性均有明顯的抑制作用（P<0.01）,對(duì)PBMC IL-6、TNFα蛋白質(zhì)和mRNA表達(dá)也有明顯抑制作用（P<0.01）.（3）單純培養(yǎng)下,MHD患者透析4h后PBMC NF-κB活性與培養(yǎng)上清液IL-6和TNFα含量呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為0.55和0.62（P<0.05）,與IL-6和TNFα mRNA表達(dá)量呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為0.70和0.66（P<0.05）.
   以上結(jié)果提示,在單次血液透析中,CDA膜可引起MHD患者PBMC NF-κB活性水平增高,且后者與透析4h后PBMC IL-6和TNFα表達(dá)增高密切相關(guān)；PS膜活化NF-κB能力較弱；阻抑NF-κB信號(hào)途徑可下調(diào)透析4h后PBMC IL-6和TNFα的表達(dá),提示NF-κB可能介導(dǎo)了單次血液透析中透析膜誘導(dǎo)的PBMC IL-6和TNFα的表達(dá)增高.
   總結(jié)
   本研究結(jié)果顯示,MHD患者透析前即存在PBMC TNFα、IL-6 mRNA和蛋白質(zhì)異常高表達(dá)；PBMC NF-κB呈異常高活化,且與IL-6、TNFαmRNA和蛋白質(zhì)異常高表達(dá)呈正相關(guān)；PDTC可阻抑NF-κB活化,同時(shí)顯著抑制PBMC IL-6、TNFαmRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá).在單次血液透析中,CDA膜血液透析可活化PBMCNF-κB,且后者與透析后PBMC IL-6和TNFα表達(dá)增高密切相關(guān)；阻抑NF-κB信號(hào)途徑可下調(diào)透析4h后PBMC IL-6和TNFα的表達(dá).本研究結(jié)果初步顯示NF-κB信號(hào)途徑可能介導(dǎo)了MHD患者PBMC IL-6和TNFα的表達(dá),為探討MHD患者透析并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制和探索治療方法提供新的思路和線索.