PRODUCT CLASSIFICATION
產(chǎn)品分類目的和要求
掌握考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)含量的原理和方法。學習分光光度計的原理及使用法。
原理
1976年Bradford建立了用考馬斯亮藍G250與蛋白質(zhì)結(jié)合的原理,迅速、敏感的定量測定蛋白質(zhì)的方法。染料與蛋白質(zhì)結(jié)合后引起染料zui大吸收的改變,從465nm變?yōu)?95nm,光吸收增加。蛋白質(zhì)染料復合物具有高的消光系數(shù),因此大大提高了蛋白質(zhì)測定的靈敏度,zui低檢出量為1μg蛋白。染料與蛋白質(zhì)的結(jié)合是很迅速的過程,大約需2min,結(jié)合物的顏色在1h內(nèi)是穩(wěn)定的。一些陽離子,如K+,Na+,Mg2+,(NH 4 ) 2 SO 4,乙醇等物質(zhì)不干擾測定,而大量的去污劑如TritonX100,SDS等嚴重干擾測定,少量的去污劑可通過用適當?shù)膶φ斩?。由于染色法簡單迅速,干擾物質(zhì)少,靈敏度高,現(xiàn)已廣泛應用于蛋白質(zhì)含量的測定。
操作步驟
一、標準方法
取含 10~100μg蛋白質(zhì)溶液于小試管中,用雙蒸水或緩沖液調(diào)體積到0.1mL,然后加入5mL蛋白試劑,充分振蕩混合,2min后于595nm測定光吸收值。以0.1mL雙蒸水或緩沖液及5mL蛋白試劑作為空白對照。
二、微量蛋白分析法
取含 1~10μg蛋白質(zhì)溶液,用雙蒸水調(diào)體積到0.8mL,加0.2mL蛋白試劑,充分振蕩混合, 2min后于595nm測定光吸收值,以0.8mL雙蒸水及0.2mL蛋白試劑作為空白對照。用不同濃度的蛋白質(zhì)溶液作標準曲線,以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標,光吸收值為縱坐標,繪制標準曲線作為定量的依據(jù)。
試劑和器材
一、試劑
1.標準蛋白質(zhì)溶液:可用牛血清清蛋白預先經(jīng)微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量,根據(jù)其純度配制成1mg/mL的溶液。或根據(jù)牛血清清蛋白的紫外消光系數(shù)A 1% 1cm=6.6來確定。
2.蛋白試劑的配制:稱取100mg考馬斯亮藍G250溶于50mL95%乙醇,加入100mL85%(W/V)磷酸,將溶液用水稀釋到1000mL。試劑的終濃度為0.01%考馬斯亮藍G250,4.7%(W/V)乙醇,和8.5%(W/V)磷酸。
二、器材
1.72型分光光度計
2.微量注射器
3.試管及試管架
4.刻度吸管
郵箱:1170233632@qq.com
傳真:021-51870610
地址:上海市顧戴路2988號B幢7樓