植物酯酶(plant’esterase,P-E)與動物膽堿酯酶(choliniesterase,ChE)一樣,酶活性可被有機磷(OP5)和氨基甲酸酯農(nóng)藥所抑制,植物酯酶(P—E)可以水解醋酸萘酯為萘酚和醋酸,萘酚與顯色劑固藍B鹽反應生成紫紅色偶氮化合物,從而完成顯色反應。一旦植物酯酶活性被農(nóng)藥所抑制,就不能完成顯色反應,表明樣品中含有農(nóng)藥。 本研究使用固化的植物酯酶代替通常使用的動物膽堿酯酶。酶來源于市售面粉,向面粉中按1:5(w/v)比例加入蒸餾水,在振蕩器上振蕩30min,以5000r/min離心20min,上清液經(jīng)濾紙過濾、濾液作為原酶液保存在4℃冰箱(或將酶液分裝后在真空冷凍干燥機上凍干成酶干粉、冰凍保存),使用前稀釋至一定倍數(shù)作為酶的工作液。取聚苯乙烯微孔反應板,用移液槍向每孔中加酶工作液20μL,使其均勻涂于孔壁,室溫下(或4℃冰箱)自然涼干后用無離子水沖洗3次,涼干、室溫干燥避光保存。微孔內(nèi)壁固定有植物酯酶的塑料板稱為農(nóng)藥酶檢測器。 采用梯度稀釋法在蒸餾水中分別配制1000μg/L、100μg/L、50μg/L、10μg/L、1μg/L的系列濃度的農(nóng)藥標準溶液,在農(nóng)藥檢測器上分別進行抑制試驗,待反應完成后,用肉眼觀察顯色結果,確定可分辨出的zui低標準溶液濃度結果證明靈敏度為10~100μg/L。 稱取不含農(nóng)藥的小白菜、蘋果各2g,分別向其表面添加不同濃度農(nóng)藥,室溫下涼干后,經(jīng)20%甲醇提取后進行抑制試驗,觀察可分辨出的zui低農(nóng)藥濃度,可得檢出限為0.1~1.Omg/kg。 將農(nóng)藥檢測器、顯色劑、基質等組裝成農(nóng)藥殘留檢測試劑盒。試劑盒與同類方法比較zui主要的區(qū)別有三點:一是試劑盒使用的是植物酯酶代替同類方法使用的乙酰膽堿酯酶(AchE)或丁酰膽堿酯酶(BuchE),酶源廣泛廉價易得:二是試劑盒使用的是固定化酶而不是同類方法使用的酶溶液,抗干擾力強;三是試劑盒使用20%甲醇作為蔬菜樣品的提取溶液而不是磷酸緩沖液或水,提取效率有所提高。 試劑盒只用于有機磷和氨基甲酸酯農(nóng)藥檢測,檢出結果只是反應出這兩類農(nóng)藥的綜合殘毒指標。它檢出的陰性樣品不表示不含有其它農(nóng)藥或低于檢測限的有機磷和/或氨基甲酸酯農(nóng)藥。