PRODUCT CLASSIFICATION
產(chǎn)品分類PCR實驗代測的模板濃度
服務內(nèi)容:
1.制定個性化實驗方案:根據(jù)不同的實驗目的確定實驗方案、選定合適的內(nèi)參;
2.檢測類別:mRNA、miRNA、lncRNA、DNA;
3.樣本抽提及質(zhì)檢:對客戶提供樣本進行RNA抽提,并利用NanoDrop進行樣本質(zhì)檢;
4.定量PCR預實驗:包括樣本反轉(zhuǎn)錄為CDNA、配置PCR反應體系及進行Real-TimePCR反應;
5.正式定量PCR實驗:根據(jù)預實驗結(jié)果進行正式實驗;
6.數(shù)據(jù)分析:采用2- △△CT法進行分析,比較不同樣本間差異。
影響Ct值的關鍵因素
模板濃度
模板濃度是決定Ct的最主要因素。控制在一個合適范圍內(nèi),使Ct在15-35之間
反應液成分的影響
任何分子的熒光發(fā)射都受環(huán)境因素影響----比如溶液的pH值和鹽濃度。
PCR反應的效率
PCR反應的效率也會影響Ct值。在PCR擴增效率低的條件下進行連續(xù)梯度稀釋擴增,與PCR擴增效率高的條件下相比,可能會所產(chǎn)生斜率不同的標準曲線。PCR效率取決于實驗、反應混合液性能和樣品質(zhì)量。一般說來,反應效率在90-110%之間都是可以接受的。
Real-time qPCR常見參數(shù)
基線(baseline)通常是3-15個循環(huán)的熒光信號
同一次反應中針對不同的基因需單獨設置基線
閾值(threshold)
自動設置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍
手動設置:置于指數(shù)擴增期,剛好可以清楚地看到熒光信號明顯增強
同一次反應中針對不同的基因可單獨設置閾值,但對于同一個基因擴增一定要用同一個閾值。
Ct值:與起始濃度的對數(shù)成線性關系。
分析定量時候一般取Ct:15-35。太大或者太小都會導致定量的不準確。
Rn(Normalized reporter)是熒光報告基團的熒光發(fā)射強度與參比染料的熒光發(fā)射強度的比值。
△Rn:△Rn是Rn扣除基線后得到的標準化結(jié)果(△Rn=Rn-基線)。
如何評估實時定量PCR反應的效果
PCR擴增效率:為了正確地評估PCR擴增效率,至少需要做3次平行重復,至少做5個數(shù)量級倍數(shù)(5logs)連續(xù)梯度稀釋模板濃度。
另一個評估PCR效率的關鍵參數(shù)是相關系數(shù)R2,它是說明兩個數(shù)值之間相關程度的統(tǒng)計學術語。如果R2等于1,那么你可以用Y值(Ct)來準確預測X值(量)。如果R2等于0,你就不能通過Y值來預測X值。R2值大于0.99 時,兩個數(shù)值之間相關的可信度很好。
PCR實驗代測的模板濃度
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