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谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT/GPT)測(cè)試盒的注意點(diǎn)

更新時(shí)間:2023-12-06      瀏覽次數(shù):479

谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT/GPT)測(cè)試盒的注意點(diǎn)

 微板法)

一、測(cè)定原理:

谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)在 37℃及 PH7.4 條件下,作用于丙

氨酸及α-酮戊二酸組成的底物,生成丙酮酸及谷氨酸。反應(yīng)

30min 后(固定時(shí)間)加入 2,4-二-硝-基-苯肼(DNPH)鹽酸溶

液,既中止反應(yīng),同時(shí) DNPH 與酮酸中羰基加成,生成丙酮

酸苯腙。苯腙在堿性條件下呈紅棕色,于 505nm 比讀吸光度

并計(jì)算酶活力。

二、試劑的組成與配制:(96T)

試劑一:谷丙轉(zhuǎn)氨酶基質(zhì)液,5mL×1 瓶,4℃冰箱保存 6 個(gè)月;

試劑二:2,4—二-硝-基-苯肼液,5mL×1 瓶,4℃冰箱保存 6 個(gè)月;

試劑三:4mol/L 氫氧化鈉液,5mL×1 瓶,室溫密封保存 6 個(gè)月;

0.4mol/L 氫氧化鈉液的配制,臨用時(shí)按 4mol/L 氫氧化鈉液:

蒸水=19 的比例稀釋,需多少配多少,室溫密封保存。

試劑四:2mmol/mL 丙酮酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液×1 支,4℃冰箱保存 6 個(gè)月;

試劑五:0.1mol/L 磷酸鹽緩沖液×1 支,4℃冰箱保存 6 個(gè)月。

三、操作過(guò)程:

1、樣本前處理:

①、血清(漿)及其它液體樣本待測(cè):直接測(cè)定。

②、動(dòng)物組織樣本:準(zhǔn)確稱取組織重量,按重量(g):體積

(mL)=1:9 的比例,加入 9 倍體積的生理鹽水,冰水浴條件

下機(jī)械勻漿,2500 轉(zhuǎn)/分,離心 10 分鐘,取上清液待測(cè)。

③、培養(yǎng)細(xì)胞樣本前處理:將收集好的細(xì)胞用等滲緩沖液(推

0.1mol/L pH77.4 磷酸鹽緩沖液或生理鹽水)清洗 1

2 次;1000 轉(zhuǎn)/,離心 10 分鐘,棄上清,留細(xì)胞沉淀,加入勻

漿介質(zhì)(推薦加入 0.1mol/L pH77.4 磷酸鹽緩沖液或生

理鹽水),冰水浴條件下超聲破碎或手動(dòng)勻漿,制備好的

勻漿液不離心,待測(cè)。

2、操作表:

1、比色法中常用的有賴氏(Reitman-Frankel)法及金氏(King

法。賴氏法標(biāo)準(zhǔn)曲線所定單位數(shù),是用實(shí)驗(yàn)方法和卡門(mén)氏分

光度法(速率法)作對(duì)比測(cè)定求得的。以卡門(mén)氏單位報(bào)

告結(jié)果,比較準(zhǔn)確。

卡門(mén)氏單位定義1mL 液體,反應(yīng)液總?cè)萘?/span> 3mL,波長(zhǎng) 340nm

1cm 光徑,25℃,1min 內(nèi)所生成的丙酮酸,使 NADH 氧化

NAD+而引起吸光度每下降 0.001 為一個(gè)單位(1 卡門(mén)氏

單位=0.482 U/L,25℃)。

2、一般血清標(biāo)本內(nèi)源性酮酸很少,血清對(duì)照孔吸光度值接近試

劑空白孔(以雙蒸水代替血清,其他和對(duì)照孔同樣操作)。

所以,成批標(biāo)本測(cè)定時(shí),一般不需要每一標(biāo)本都作本身血清

對(duì)照孔,以試劑空白孔代替即可,但對(duì)脂血、黃疸或溶血血

清,每份標(biāo)本應(yīng)作對(duì)照孔。

3、酶活力超過(guò) 150 卡門(mén)氏單位時(shí),用生理鹽水稀釋血清后重測(cè)。

4、應(yīng)將一般血清的對(duì)照孔(或稱標(biāo)本空白孔)的吸光度作為日

常質(zhì)控的指標(biāo)之一;如相差大,可考慮α-酮戊二酸濃度、DNPH

濃度及儀器等原因引起。

5、血清中 ALT 在室溫(25℃)可保存 2 天,在 04℃可保存一

周,在-25℃可保存 1 個(gè)月。

附錄Ⅰ:ALT 標(biāo)準(zhǔn)曲線

1、操作表:

附錄Ⅱ:組織中 ALT 測(cè)定

1、樣本前處理:

準(zhǔn)確稱取組織重量,按重量(g):體積(mL)=1:9 的比例,加入 9 倍體

積的生理鹽水,冰水浴條件下機(jī)械勻漿,制成 10%的組織勻漿,2500

轉(zhuǎn)/,離心10分鐘,取上清液,再用生理鹽水稀釋到適宜濃度(通過(guò)標(biāo)

準(zhǔn)曲線后計(jì)算得勻漿液卡門(mén)氏單位值小于 150)待測(cè)。(取部分上清

液測(cè)蛋白濃度,蛋白定量試劑盒本所有售)

2、操作表:

組織中 活力= 通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線得 ?待測(cè)勻漿液蛋白

勻漿液ALT活力 濃度

附錄Ⅲ:血清(漿)中 ALT 測(cè)定

1、前處理:

血清(漿)直接取樣進(jìn)行測(cè)定。(若酶活力超過(guò) 150 卡門(mén)氏單位

時(shí),需用生理鹽水稀釋血清后重新測(cè)定)

2、操作表:

谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT/GPT)測(cè)試盒的注意點(diǎn)



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