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影響western blot實(shí)驗(yàn)的因素你知道多少!

更新時(shí)間:2022-03-01      瀏覽次數(shù):1058

影響western blot實(shí)驗(yàn)的因素你知道多少!

Western Blot實(shí)驗(yàn)又稱(chēng)蛋白質(zhì)印跡法(免疫印跡試驗(yàn)),它是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的一種實(shí)驗(yàn)方法。其基本原理是通過(guò)特異性抗體對(duì)凝膠電泳處理過(guò)的細(xì)胞或生物組織樣品進(jìn)行著色。通過(guò)分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細(xì)胞或組織中表達(dá)情況的信息。

Western blotting是一個(gè)步驟繁多的實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)中的每一步都會(huì)對(duì)最后的結(jié)果產(chǎn)生影響,下面將為你總結(jié)一些影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因素:

1. 樣品質(zhì)量

所抽取樣品的蛋白含量,蛋白變性是否充分等等,還有,蛋白樣品的PH值是否在7~8之間。這會(huì)直接影響到樣品濃縮的效果。此外,蛋白樣品是否降解、目的蛋白是否已抽取充分都會(huì)對(duì)最終結(jié)果的可靠性有影響。

2.凝膠質(zhì)量

不連續(xù)SDS-PAGE膠對(duì)凝膠的要求較高,具體的影響因素有:(1)分離膠的PH值應(yīng)在8.8左右,而濃縮膠的PH應(yīng)在6.8左右,最好不要差過(guò)0.5個(gè)PH單位,因?yàn)檫@個(gè)PH條件是保證電泳液中的甘氨酸不電離的必要條件,也是保證能充分壓縮樣品的前提。因此,制備凝膠的時(shí)候所用Tris-HCl緩沖液的PH值是否穩(wěn)定是很重要的。(2)用丙烯酰胺的純度和凝膠聚合時(shí)間,不純的丙烯酰胺會(huì)含有丙烯酸,它會(huì)影響到凝膠內(nèi)部局部PH環(huán)境,因此會(huì)影響電泳的效果,沒(méi)有聚合充分的凝膠會(huì)含有游離的丙烯酰胺,也會(huì)影響到局部PH環(huán)境,它們還會(huì)與蛋白上的氨基、巰基以及酚羥基反應(yīng)影響蛋白的泳動(dòng)。凝膠聚合時(shí)間以分離膠>45min,濃縮膠>20min為宜。此外,單體放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)也會(huì)造成丙烯酸的累積。(3)凝膠母液混合是否均勻也會(huì)影響到凝膠濃度的分布。(4)配備的母液中丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺的比例也會(huì)影響到網(wǎng)孔的大小,因此也會(huì)對(duì)電泳的質(zhì)量有影響。(5)APS及TEMED的加入量,APS極易潮解而失去活性,因此最好是現(xiàn)用現(xiàn)配,APS不宜加入過(guò)多,否則會(huì)氧化蛋白樣品。(6)點(diǎn)樣孔底部要平整。

3. 點(diǎn)樣

樣品盡量不要與電泳液混合,這樣能提高濃縮的效果,因?yàn)殡娪疽篜H值為8.3,而樣品為7.5,混合后會(huì)影響到樣品的PH值,進(jìn)而影響濃縮效果。因此,建議點(diǎn)樣最好用長(zhǎng)qiang頭,或者加樣器,輕輕的將樣品加到孔的底部。還有,加樣之前最好先沖洗一下加樣孔底部,減少?zèng)]有聚合的丙烯酰胺的影響。盡量從加樣孔的中間點(diǎn)樣,這樣能使得樣品在加樣孔中的濃度分布盡量均勻,這也會(huì)對(duì)最終蛋白條帶的形狀有影響的。加樣量也不能過(guò)高或過(guò)低,過(guò)高會(huì)影響條帶的形狀,過(guò)低不利于后面的雜交反應(yīng)。

4. 電泳緩沖液

盡量用新鮮配制的。這樣能保證PH值和離子強(qiáng)度的穩(wěn)定。

5. 電壓條件

電壓過(guò)高,一方面會(huì)使凝膠溫度上升,改變凝膠內(nèi)部PH值,甚至?xí)斐扇苣z,另一方面,電流過(guò)大也不利于蛋白分子的分離,容易造成條帶變形,電壓過(guò)低,又會(huì)有樣品擴(kuò)散的影響。我們經(jīng)常用的濃縮時(shí)80V,分離時(shí)100V比較好,條帶很平。

6. 轉(zhuǎn)膜

先是膜的選擇,主要從實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛯?shí)驗(yàn)要求來(lái)考慮。例如,要做分子量小于20kD的小蛋白,0.45μm的NC膜是不可取的,因?yàn)檫@樣可能會(huì)使得蛋白因透過(guò)膜孔而造成膜結(jié)合的目的蛋白量不確定,從而影響到最終結(jié)果的可靠性。而如果所分離的蛋白需要進(jìn)行測(cè)序,則非PVDF膜不可,因?yàn)橹挥蠵VDF膜才能經(jīng)受住嚴(yán)酷的清洗條件。其次是轉(zhuǎn)膜方法的選擇。主要有半干法轉(zhuǎn)膜和濕法轉(zhuǎn)膜。半干法操作要求高,但效率也高。濕法操作要求相對(duì)低,花時(shí)間多一些。

7. 抗體雜交與底物顯色

一抗盡量選擇小鼠或者兔來(lái)源的單克隆抗體,還有要注意所用的抗體是否能夠識(shí)別變性條件下的目標(biāo)蛋白;二抗一般都是效價(jià)很高的,只要室溫下雜交1小時(shí)就可以了,適當(dāng)延長(zhǎng)也是可以的。另外,要選擇靈敏度較高的化學(xué)反應(yīng)底物。如英格恩生物的超敏型ECL發(fā)光液Enlight-Plus,檢測(cè)級(jí)別可達(dá)pg級(jí),發(fā)光時(shí)間長(zhǎng),穩(wěn)定。



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