考馬斯亮藍(lán)法測蛋白含量的正確使用方法！

樣品可溶性蛋白質(zhì)含量常常用于酶活性計算。此外，可溶性蛋白質(zhì)含量也用于食品等質(zhì)量分析。

在酸性溶液中，考馬斯亮藍(lán)G-250與蛋白質(zhì)結(jié)合形成藍(lán)色復(fù)合物；該復(fù)合物在595nm處有最大吸收峰， 其顏色的深淺與蛋白質(zhì)的濃度成正比。該方法靈敏度高，適合微量蛋白質(zhì)分析。

使用所需設(shè)備：

產(chǎn)品組成：

試劑一：液體×1瓶，4℃保存。

標(biāo)準(zhǔn)品：液體×1瓶，4℃保存。

樣品中可溶性蛋白質(zhì)提取：

液體樣品：澄清無色液體樣品可以直接測定。

組織樣品：準(zhǔn)確稱取約0.1 g樣品，加1mL提取液（自備，根據(jù)需要選用酶提取緩沖液或者蒸餾水或者生理鹽水），冰浴勻漿，10000rpm，4℃離心10min，取上清，即待測液。（動物樣品常常需要稀釋）

吸光值測定：

1. 分光光度計預(yù)熱30 min以上，蒸餾水調(diào)零。

2. 空白管：取0.5mL EP管，加入40μL蒸餾水，250μL試劑一，混勻后室溫靜置10min，取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板，于595nm比色，10~20min完成比色，記為A空白管。

3. 標(biāo)準(zhǔn)管：取0.5mL EP管，加入40μL標(biāo)準(zhǔn)液，250μL試劑一，混勻后室溫靜置10min，取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板，于595nm比色，10~20min完成比色，記為A標(biāo)準(zhǔn)管。

4. 測定管：取0.5mL EP管，加入40μL待測液，250μL試劑一，混勻后室溫靜置10min，取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板，于595nm比色，10~20min完成比色，記為A測定管。

蛋白質(zhì)含量計算公式：

C待測（µg/m L）= C標(biāo)準(zhǔn)管×(A測定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)

                =50×(A測定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)

C標(biāo)準(zhǔn)管：標(biāo)準(zhǔn)品蛋白質(zhì)濃度，50μg/mL。

注意事項：

1.加考馬斯亮藍(lán)后，在10~20min內(nèi)吸光值相對較穩(wěn)定，因此須在10~20min完成比色。

2.不宜用石英比色皿，可用玻璃或塑料比色皿，測完成后立即用95%乙醇沖洗。

3.測定前用1~2個樣做預(yù)實(shí)驗(yàn)，確保蛋白濃度在0~100µg/ml范圍內(nèi)，否則需要做相應(yīng)稀釋。