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產(chǎn)品分類WB實(shí)驗(yàn)中關(guān)于抗體選購的幾個(gè)注意事項(xiàng),上海信帆生物提供Western Blot檢測服務(wù),下面我們就Western Blot幾個(gè)常規(guī)問題進(jìn)行解答!
Q:如何選擇各個(gè)公司的抗體?
A:抗體可盡量選擇進(jìn)口原裝抗體,如Abcam,CST,Santa cruz等公司的抗體。根據(jù)靶蛋白的種屬(如人,小鼠,大鼠等)以及實(shí)驗(yàn)用途(WB,免疫組化,細(xì)胞免疫熒光等)在各個(gè)公司的網(wǎng)頁上選擇合適的抗體。選擇抗體時(shí)務(wù)必注意核對基因NCBI的序列號,以防止因?yàn)榛虻膭e名等原因?qū)е沦I錯(cuò)抗體。另外再購買抗體時(shí)需注意是否提供完善的售后服務(wù),在廠商規(guī)定的時(shí)間內(nèi)未能得到預(yù)期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可將詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)信息交給抗體公司進(jìn)行質(zhì)量投訴,一般提供充分的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)并且在保質(zhì)期內(nèi)可以得到抗體調(diào)換等售后服務(wù)。
Q:抗體使用有哪些注意事項(xiàng)?
A:使用抗體前需仔細(xì)閱讀說明書,了解抗體的保存條件以及不同用途下的推薦稀釋比例。較高濃度的抗體(>0.5mg/mL)通常性質(zhì)更穩(wěn)定,受生物試劑工藝和成本控制等因素影響,不同品牌的抗體的濃度也不相同,所以購買時(shí)應(yīng)注意比較,經(jīng)驗(yàn)不足的實(shí)驗(yàn)者往往被抗體的體積迷惑,要注意相同質(zhì)量下低濃度的抗體體積反而更大。
Q:為什么各個(gè)抗體都要進(jìn)行 WB預(yù)實(shí)驗(yàn)?
A:對WB結(jié)果有決定性影響的因素是抗體的效價(jià)和如果正確使用手中的抗體。正確使用抗體可以保證抗體效價(jià)不被過分的拮抗,與抗原更加有效的結(jié)合,從而獲得特異性和非特異性背景之間差異的大化。每一個(gè)抗體都有其特性,因此我們必須通過WB預(yù)實(shí)驗(yàn)獲得背景小,非特異性條帶少的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
預(yù)實(shí)驗(yàn)的內(nèi)容如下:
1)確定一抗的稀釋比例和孵育時(shí)間;
2)選擇合適的封閉液及封閉時(shí)間;
3)調(diào)節(jié)合適的上樣量,使內(nèi)參條帶灰度值趨于一致。
Q:半干轉(zhuǎn)和濕轉(zhuǎn)的優(yōu)缺點(diǎn)有哪些?如何選擇?
A:半干轉(zhuǎn)和濕轉(zhuǎn)兩種轉(zhuǎn)膜方式各有優(yōu)劣。濕轉(zhuǎn)適合所有的蛋白尤其分子量大的蛋白,轉(zhuǎn)膜效率佳,但對試劑消耗量較大,轉(zhuǎn)膜時(shí)間長于半干轉(zhuǎn);半干轉(zhuǎn)適合分子量小于100KD的蛋白,省時(shí)、省試劑。
Q:什么是WB的灰度半定量分析?
A:通常用Image J 或photoshop軟件對各個(gè)樣本的目的蛋白及其內(nèi)參蛋白曝光后膠片的灰度值進(jìn)行計(jì)算,按照灰度值的高低來半定量分析各個(gè)樣品中蛋白的表達(dá)差異。
Q:WB進(jìn)行幾次重復(fù)實(shí)驗(yàn)?
A:我們常規(guī)報(bào)價(jià)的服務(wù)內(nèi)容為進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)(摸索實(shí)驗(yàn)條件)并提供一次正式實(shí)驗(yàn)WB膠片結(jié)果。預(yù)實(shí)驗(yàn)一般會(huì)對封閉條件,抗體濃度,孵育時(shí)間等條件進(jìn)行多次重復(fù)以獲得一次優(yōu)的正式實(shí)驗(yàn)結(jié)果??蛻羧粢筮M(jìn)行2-3次的生物學(xué)重復(fù)實(shí)驗(yàn),請?jiān)诤炗喓贤疤貏e說明,我們會(huì)根據(jù)工作量的增加收取相應(yīng)的費(fèi)用。
WB實(shí)驗(yàn)中關(guān)于抗體選購的幾個(gè)注意事項(xiàng)
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