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產(chǎn)品分類明膠酶譜分析試劑盒為什么老出不了條帶,看過來!
很多老師反應(yīng)在操作明膠酶譜試劑盒的時候,有時候很難出現(xiàn)漂亮的條帶,信帆生物為您答疑解惑!
如果您對基質(zhì)金屬蛋白酶MMP2,MMP9感興趣,歡迎找上海信帆生物科技有限公司!
1.樣本失活
2.電泳操作不對,配膠不均,有氣泡,溫度控制不當(dāng)?shù)取?/span>
3.孵育時間不夠。由于某些樣本活性太低,孵育時間不夠,很難出現(xiàn)漂亮的條帶。
我們在明膠酶譜分析試劑盒時候的注意事項:
1.制備聚丙烯酰胺時應(yīng)注意排除氣泡。
2.明膠酶譜的活性受鈣離子,鋅離子,和PH值等因素的影響,因此緩沖液配制應(yīng)嚴格準(zhǔn)確,盡量用超純水,孵育溫度也掌握好。
3.用大梳子
4.孵育液的PH在7.5-7.6,復(fù)性的TRITON時間長了會有絮狀物,所以實驗時盡量使用新鮮配置的。
5.孵育的37度不要在CO2培養(yǎng)箱中,因為會改變孵育液的PH值,在普通孵箱即可。
明膠酶譜分析試劑盒檢測步驟:
1 制備含MMP底物蛋白的SDS-PAGE凝膠:推薦分離膠濃度為8%。按照標(biāo)準(zhǔn)程序制備SDS PAGE凝膠。將10 × substrate G 融化,并90 ºC 加熱5分鐘。分別在濃縮膠和分離膠中額外加入10 × substrate G 并使之稀釋10倍,混勻后加入過硫酸銨和TEMED,等待凝膠聚合。
2 待測樣品1:1 稀釋于2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用完后可自行配制:4% SDS, 100 mM Tris-Cl pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue),混合后直接上樣。切勿加熱變性,并且僅使用不加還原劑的上樣緩沖液??赏ㄟ^預(yù)試驗確定加樣量,使用普通蛋白預(yù)染Marker 即可。陽性對照(可選步驟):可取人、小鼠、大鼠或兔100μl 全血與100μl 2 × SDS-PAGE nonreducing buffer 等體積混合,取5-15μl 上樣。
3 低電流恒流電泳,每一塊小膠電流為20 mA/gel。溴酚藍跑出凝膠前沿時結(jié)束電泳。
4 洗滌凝膠:取出凝膠,去除濃縮膠,放入容器內(nèi)??上扔眠m量蒸餾水沖洗凝膠,然后加入10 ml 1× Buffer A(用蒸餾水稀釋),室溫漂洗凝膠2 × 30 分鐘。中間換液。
5 孵育:倒掉Buffer A。加入10 ml 1× Buffer B(蒸餾水稀釋),室溫或37ºC 孵育1~5 小時。陽性對照或者血中的MMP 通常37ºC 孵育1 小時即可顯示。如MMP 活性低,應(yīng)延長孵育時間為10小時或過夜。
6 顯色:倒掉Buffer B,加入SDS-PAGE凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍染色液(操作步驟見后面所附SDS-PAGE凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍染色液說明書)。凝膠的大部分區(qū)域被深染,在有MMP 條帶的位置不被染色而形成透亮區(qū)域。透明區(qū)域的位置和范圍指示MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶譜)及活性。陽性對照將在66~72 (MMP-2)、92 (MMP-9)、130 (proMMP-9)、225 (proMMP-9) kDa位置出現(xiàn)透明條帶。
7 條帶掃描:將凝膠放在掃描儀上掃描。雖然MMP條帶透明,但凝膠背景并非真正全黑。解決辦法:可用非透射光掃描,或用軟件圖像處理程序調(diào)整背景顯示為灰度顯示,并盡量設(shè)置為黑色。MMP 條帶則為白色,這種背景黑條帶白的格式是英文論文中zui常見的格式。
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明膠酶譜分析試劑盒為什么老出不了條帶,看過來!
上海信帆生物供應(yīng)明膠酶譜分析試劑盒,操作簡單,重復(fù)性好,靈敏度高,提供技術(shù)指導(dǎo)和售后服務(wù)!
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