信帆生物為您提供：I型鼠尾膠原蛋白的使用方法

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鼠尾膠原蛋白 I 型(rattailtendon collagen type I)是通過(guò) Birkedal-Hansen 的方法，通過(guò)醋酸抽提、氯化鈉沉淀、磷酸氫二鈉沉淀等步驟制備的。本公司鼠尾膠原蛋白可用于包被細(xì)胞培養(yǎng)器皿，培養(yǎng)一些在普通細(xì)胞培養(yǎng)器皿中不易貼壁的細(xì)胞。也可用于制備三維膠，模擬真實(shí)的生長(zhǎng)環(huán)境，使細(xì)胞在三維環(huán)境中生長(zhǎng)。

1，在使用鼠膠原蛋白 I 型包被的細(xì)胞培養(yǎng)皿中檢查到 PC-12 細(xì)胞的貼壁和生長(zhǎng)。

2，在 1mg/ml 濃度以上，pH 為 7 左右時(shí)可形成具有一定強(qiáng)度的三維膠，檢查到 NIH-3T3 細(xì)胞在三維膠內(nèi)正

常生長(zhǎng)、PC-12 細(xì)胞在三維膠表面正常生長(zhǎng)。

使用方法：

1、細(xì)胞培養(yǎng)器皿的表面包被 推薦濃度： 1-5ug/cm2

以包被濃度為 2 ug/cm2為例：用無(wú)菌 0.006mol/L(0.36g/L) 乙酸將膠原蛋白稀釋到 0.012mg/ml。

確保膠原蛋白溶液鋪滿(mǎn)器皿的表面，開(kāi)蓋在超凈臺(tái)上過(guò)夜晾干。 也可以在室溫放置 1小時(shí)后，用PBS洗3-4次后直接使用。包被好的器皿在 4-25℃至少可保存3個(gè)月以上的時(shí)間。

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2、三維膠原的制備

鼠尾膠原蛋白I型在濃度1mg/mL以上，pH 7左右時(shí)可形成具有一定強(qiáng)度三維膠，建議成膠濃度1-2mg/mL。膠原蛋白溶解于0.006mol/L 乙酸中，在成膠過(guò)程中需要加入0.06×體積的 0.1mol/L NaOH 來(lái)中和。

需要的溶液（均需要無(wú)菌、預(yù)冷）：10×PBS（可含10 mg/L的酚紅用于pH指示）或10×培養(yǎng)液，0.1mol/L NaOH，0.1mol/L 乙酸(一般不用)，雙蒸水

A． 不含細(xì)胞的三維膠原的制備（以配制1mL，1mg/mL三維膠為例）：將200μL鼠尾膠原蛋白I型(5mg/mL)加到置于冰浴的離心管中，加入 690μL H2O。然后加到12μL 0.1mol/L NaOH中（如果反過(guò)來(lái)把12μL 0.1mol/L NaOH加到膠原溶液中，會(huì)由于NaOH不能迅速混勻而產(chǎn)生局部的膠原凝結(jié)），立即混勻。再加入100μL 10×PBS或10×培養(yǎng)液，混勻后立即加到培養(yǎng)器皿中(混勻后pH為7左右，如果PBS或培養(yǎng)液中沒(méi)有加酚紅，初次使用時(shí)需要用pH試紙測(cè)試)。將培養(yǎng)器皿在室溫(25度左右)下放置20分鐘待膠凝固后，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱內(nèi)。如果配制中使用的是10×PBS，使用前需要加入適當(dāng)體積的細(xì)胞培養(yǎng)液預(yù)平衡。

B．含細(xì)胞的三維膠原的制備（以配制1 mL，1mg/mL三維膠為例）：準(zhǔn)備好懸浮于培養(yǎng)液的細(xì)胞，并放置于冰浴中。將200μL鼠尾膠原蛋白I型 (5mg/mL)加到12μL 0.1mol/L NaOH中（如果反過(guò)來(lái)把12μL 0.1mol/L NaOH加到膠原溶液中，會(huì)由于NaOH不能迅速混勻而產(chǎn)生局部的膠原凝結(jié)），立即混勻。再加入23μL 10×PBS或10×培養(yǎng)液，混勻(混勻后pH為7左右，如果PBS或培養(yǎng)液中沒(méi)有加酚紅，初次使用時(shí)需要用pH試紙測(cè)試)。加入760μL的細(xì)胞懸浮液，混勻后立即加到培養(yǎng)器皿中。將培養(yǎng)器皿在室溫下放置20分鐘待膠凝固后，加入適當(dāng)體積的細(xì)胞培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

注意事項(xiàng)：

鼠尾膠原蛋白I型在室溫下pH中性時(shí)可迅速成膠，在操作過(guò)程中要盡量保持低溫。

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