JC-1法檢測線粒體膜電位，以及檢測線粒體膜電位的操作步驟！

線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1 法)(Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1)是一種以 JC-1 為熒光探針，快速靈敏地檢測細胞、組織或純化的線粒體膜電位變化的試劑盒，可以用于早期的細胞凋亡檢測，CCCP 作為誘導線粒體膜電位下降的陽性對照。該試劑盒僅用于科研領域，不宜用于研究診斷或其他用途。

產品組成：

操作步驟(僅供參考)：

1、配制 JC-1 染色工作液：

取適量 JC-1 Stain (200×)，按照每 50μl JC-1 Stain (200×)加入 8ml ddH₂O 的比例稀釋 JC-1，劇烈 Vortex 充分溶解并混勻 JC-1 Stain。然后再加入 2ml JC-1 Buffer(5×)，

混勻后即為 JC-1 染色工作液。6 孔板每孔所需 JC-1 染色工作液的量為 1ml，其它培養(yǎng)器皿的 JC-1 染色工作液的用量以此類推；對于細胞懸液每 0.5～1.0×10⁶ 細胞需 0.5ml JC-1 染色工作液。

2、設置陽性對照：

推薦 CCCP(10mM)按照 1:1000 的比例加入到細胞培養(yǎng)液中，稀釋至 10μM，處理細胞20min。隨后按照下述方法裝載 JC-1，進行線粒體膜電位的檢測。對于大多數(shù)細胞，通常 10μM CCCP 處理 20min 后線粒體的膜電位會*喪失，JC-1 染色后觀察應呈綠色熒光；而正常的細胞經(jīng) JC-1 染色后應顯示紅色熒光。對于特定的細胞，CCCP 的作用濃度和作用時間可能有所不同，需自行參考相關文獻資料確定。

3、對于懸浮細胞：

• 取 1～6×10⁵ 細胞，重懸于 0.5ml 細胞培養(yǎng)液中，細胞培養(yǎng)液中可以含血清和酚紅。

• 加入 0.5ml JC-1 染色工作液，顛倒數(shù)次混勻。細胞培養(yǎng)箱中 37℃孵育 20min。

• 在孵育期間，按照每 1ml JC-1 Buffer(5×)加入 4ml 蒸餾水的比例，配制適量的 JC-1 Buffer(1×)，并放置于冰浴。

• 37℃孵育結束后， 4℃ 600g 離心 3～4min，沉淀細胞。棄上清，注意盡量不要吸除細胞。

• 用 JC-1 Buffer(1×)洗滌 2 次：加入 1ml JC-1 Buffer(1×)重懸細胞，4℃ 600g 離心3～4min，沉淀細胞，棄上清。再加入 1ml JC-1 Buffer(1×)重懸細胞，4℃ 600g 離心

3～4min，沉淀細胞，棄上清。

• 再用少量 JC-1 Buffer(1×)重懸后，用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察，也可以用熒光分光光度計檢測或流式細胞儀分析。

JC-1法檢測線粒體膜電位，以及檢測線粒體膜電位的操作步驟！

4、對于貼壁細胞：

注意：對于貼壁細胞，如果希望采用熒光分光光度計或流式細胞儀檢測，應先收集細胞，重懸后參考懸浮細胞的檢測方法。

• 吸除 6 孔板培養(yǎng)液，根據(jù)具體實驗如有必要可以用 PBS 或其它適當溶液洗滌細胞一次，加入 1ml 細胞培養(yǎng)液。細胞培養(yǎng)液中可以含有血清和酚紅。

• 加入 1ml JC-1 染色工作液，充分混勻。細胞培養(yǎng)箱中 37℃孵育 20min。

• 在孵育期間，按照每 1ml JC-1 Buffer(5×)加入 4ml 蒸餾水的比例，配制適量的 JC-1 Buffer(1×)，并放置于冰浴。

• 37℃孵育結束后，吸除上清，用 JC-1 Buffer(1×)洗滌 2 次。

• 加入 2ml 細胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)液中可以含有血清和酚紅。

• 熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下觀察。

5、對于純化的線粒體：

• 把配制好的 JC-1 染色工作液再用 JC-1 Buffer(1×)稀釋 5 倍。

• 0.9ml JC-1 染色工作液中加入 0.1ml 總蛋白量為 10～100μg 純化的線粒體。

• 用熒光分光光度計或熒光酶標儀檢測：混勻后直接用熒光分光光度計進行時間掃描，激發(fā)波長為 485nm，發(fā)射波長為 590nm。如果使用熒光酶標儀，激發(fā)波長不能設置為 485nm 時，可以在 475～520nm 范圍內設置激發(fā)波長。另外，也可以參考下面步驟 6

中的波長設置進行熒光檢測。 d. 用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察：方法同下面的步驟 6。

6、熒光觀測和結果分析：

檢測 JC-1 單體時可以把激發(fā)光設置為 490nm，發(fā)射光設置為 530nm；檢測 JC-1 聚合物時，可以把激發(fā)光設置為 525nm，發(fā)射光設置為 590nm。注意：此處測定熒光時不必把激發(fā)光和發(fā)射光設置在zui大激發(fā)波長和zui大發(fā)射波長。如使用熒光顯微鏡觀察，檢測 JC-1 單體時可以參考觀察其它綠色熒光時的設置，如觀察 GFP 或 FITC 時的設置；檢測 JC-1 聚合物時可以參考觀察其它紅色熒光，如碘化丙啶或 Cy3 時的設置。出現(xiàn)綠色熒光說明線粒體膜電位下降，并且該細胞很可能處于細胞凋亡早期。出現(xiàn)紅色熒光說明線粒體膜電位比較正常，細胞的狀態(tài)也比較正常。

注意事項：

1、 JC-1 Stain(200×)應*溶解混勻后使用，但應避免反復凍融。必須先把 JC-1 用 ddH₂O 充分溶解混勻后，才可加入 JC-1 Buffer(1×)。不可先配制 JC-1 Buffer(1×)再加入

JC-1 Stain(200×)，否則導致 JC-1 很難充分溶解，嚴重影響后續(xù)的檢測。

2、 對于 6 孔板中的樣品，本試劑盒共可以檢測 100 個樣品；對于 12 孔中的樣品，本試劑盒共可以檢測 200 個樣品。

3、 裝載完 JC-1 后用 JC-1 Buffer(1×)洗滌時，盡量使 JC-1 Buffer(1×)保持 4℃左右，此時的洗滌效果較好。

4、 JC-1 探針裝載完并洗滌后盡量在 30min 內完成后續(xù)檢測，在檢測前需冰浴保存。

5、 勿把 JC-1 Buffer(5×)全部配制成 1×，因為操作過程中需直接使用 JC-1 Buffer(5×)。6、 如 JC-1 Buffer(5×)中有沉淀，必須全部溶解后才能使用，為促進溶解可以在 37℃加熱。7、 CCCP 為線粒體電子傳遞鏈抑制劑，有一定毒性，請注意小心防護。

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