ELISA檢測試劑盒常見問題及解決建議
Q1稱樣時,樣品是放在管底還是管口,如果放在管口對檢測結果有什么影響?
答:稱量過程中,樣本應盡量稱量在試管底部,若樣本粘附在試管口,會使提取液不能與樣本充分接觸,造成提取不充分,從而影響檢測結果。
Q2是否可以將樣本提前稱量至離心管放置冰箱冷藏保存,待第二天實驗使用?
答:建議冷凍保存,并注意避免交叉污染。
Q3吸取有機試劑時,有機試劑容易從槍頭滴落,如何避免?
答:吸取有機試劑應使用刻度吸管或瓶口分液器。使用移液器吸取有機試劑會導致移液器的損壞,且吸取量不準確。飽和蒸氣壓越大的液體(易揮發(fā)液體)越容易出現液滴低落的現象,若必須使用移液器吸取,可將槍頭與移液器緊密連接,減輕滴落現象的發(fā)生。
Q4前處理時,樣本離心5分鐘和離心10分鐘有什么區(qū)別?
答:樣本前處理的目的是去除雜質以達到試劑盒能夠檢測的狀態(tài),離心是去除雜質的一種手段。離心可以分離液-液,液-固等非均一體系,離心的效果與需要分離的兩相性質有很大關系:若固體樣本的顆粒較小不易分離,則離心所需時間較長;若液體樣本與提取液極性相差較大且不易發(fā)生乳化,則離心所需時間較短。試劑盒說明書中提到的離心時間是經過大量實驗驗證所得到的,建議按照說明書操作。
Q5離心轉速和離心力有什么區(qū)別?
答:離心轉速有相對離心力(RFC,單位g)和每分鐘轉速(rpm,單位r/min)兩種表達方式,兩者換算公式為RFC=1.118*10-6*(rpm)2*r,其中r為旋轉半徑。維德維康試劑盒實驗過程中使用的離心力為4000g,應避免與4000r/min混淆。
Q6藥物殘留檢測實驗中對水質的要求:三蒸水、蒸餾水、純凈水還是去離子水?
答:理論來說這幾種水均可滿足分析要求,但對于某些項目有一定的區(qū)別。建議使用去離子水和三蒸水,蒸餾水和純凈水一般僅用于洗滌液的配置。
Q7器具污染所造成的原因有哪幾種?
答:①檢樣過程中出現含量較高的陽性樣品;
?、趯嶒炂骶邲]有清洗干凈;
?、蹖嶒炄藛T用藥污染或其他外源性污染;
?、芨邼舛葮似穬湟罕4娌划斣斐晌廴?。
建議:易被污染或使用周期較長的實驗器具,定期(3-5個月)更新一次。
Q8同一個樣品檢測兩次,檢測值差異較大,可能是由于什么原因導致的?
答:正常情況下,板孔間的變異不會對樣本的檢測結果造成影響,可能造成此結果的情況有:
①某一實驗操作前處理發(fā)生污染或失誤(稱樣量、添加樣品提取液或有機溶劑的量不準確,渦動離心提取上層清液時混入大量雜質);
?、谀骋粚嶒灆z測分析過程出現失誤(添加樣品的量,酶或抗體的量,添加AB液或終止液的量不準)。
Q9藥殘檢測時,樣品前處理過程中所用氮氣可否用壓縮空氣代替?
答:一般情況下,需要檢測的目標物是比較穩(wěn)定的藥物,可以用壓縮空氣代替氮氣。如有特殊藥物可能發(fā)生氧化影響檢測結果,則不可以使用壓縮空氣,具體藥物可向廠家咨詢。
Q10添加回收率實驗中添加濃度如何選擇?
答:添加回收率是驗證整個實驗過程準確度的指標之一。添加濃度的選擇盡量避免在zui低檢測限以內或者超出試劑盒曲線外的濃度,建議參照目標藥物在相應樣品中的判定限、定量限或曲線中間范圍濃度。同時,需根據具體的添加濃度對所用高標進行適當的稀釋,保證添加量的準確性。
添加回收的體積公式:V=C*1000M/P
其中:V為添加的高標體積(μl),C為添加的濃度(ppb),P為高標的濃度(ppb),M為樣本的質量(g)。
Q11樣本的吸光度值為什么會超出曲線上zui大OD值?
答:①標準品回溫時間不夠;
?、跇颖局泻蟹菢颖净|的物質,如有機溶劑;
?、蹣颖緩腿芤合♂屽e誤或直接用去離子水作為復溶液;
?、芰銟似繁晃廴?;
?、莘磻獣r間錯誤;
樣本的抑制率在100%-120%范圍內,一般可以初步判斷樣本為陰性。若大部分樣本的抑制率遠超過120%,建議咨詢或重復實驗。
Q12吹干步驟為什么選擇水浴或金屬浴?
答:有機溶劑的沸點一般在60-90℃不等,為加快有機試劑的揮發(fā),選擇水浴加熱或金屬浴加熱。加熱溫度應根據待測化合物的性質與提取試劑的沸點來確定,若待測化合物熱穩(wěn)定性好,不易降解或變性,可適當提高氮吹溫度。建議使用說明書中給出的溫度。
Q13回收率能否驗證實驗過程及數據的準確性?
答:一般用質控樣品(已知濃度的樣品)的實驗結果來反映檢測的準確性。在沒有質控樣本對照的情況下,空白樣本添加回收率是對操作準確性、操作環(huán)境及分析試劑的評價指標之一。因此,回收率也是實驗成功與否的一個重要判定依據。
在ELISA檢測方法實際應用過程中,回收率只是一個參考指標,其值只要穩(wěn)定在一定范圍內,檢測結果即具有參考性。
Q14同一個樣品,*次檢測顯示強陽性,第二次檢測時卻顯示陰性,什么原因?
答:①點樣的過程中出現跳孔;
?、诎蹇壮霈F較大的變異系數;
③樣本在前處理過程中被污染;
?、軜颖净旌喜痪鶆?。
建議出現高陽性樣本時應保留該樣本液,與重新處理好的樣本液一起點樣分析。
Q15同檢測結果出現陽性應該怎么處理?
答:應及時進行復檢工作。若檢測結果存在大面積陽性,應首先查找原因,并及時復檢。若復檢結果仍為陽性應及時保存該樣本,并使用儀器進行確證;如復檢為陰性,則極大可能*次實驗中存在污染或其他失誤導致假陽性。
Q16冬天實驗室溫度過低可否將試劑盒置于室溫保存?
答:不可以。冬天晝夜溫差的改變也會對試劑盒的性能造成不可逆的傷害,應嚴格按照說明書規(guī)定保存。
Q17實驗結果出現白板如何排查問題?
答:出現該問題時要分情況解決:
1.標準曲線顯色正常,樣本均為陽性:證明試劑盒性能正常,樣本遭到大面積污染或前處理過程出現重大失誤,建議重新取樣做復檢。
2.整板均不顯色或OD值很低:考慮酶和抗體取用錯誤,點板過程過程中的污染(尤其是洗板過程)或廠家技術人員協助找到原因。